| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第18-45页 |
| 1.1 冷冻电镜三维重构技术 | 第18-26页 |
| 1.1.1 三维重构的基本原理 | 第19-21页 |
| 1.1.2 冷冻制样技术 | 第21-22页 |
| 1.1.3 冷冻电镜成像技术 | 第22-23页 |
| 1.1.3.1 反差形成机制 | 第22页 |
| 1.1.3.2 低剂量成像技术 | 第22-23页 |
| 1.1.4 图像的解调制 | 第23-24页 |
| 1.1.5 冷冻电镜技术中的新装备 | 第24-26页 |
| 1.2 电镜三维重构基本方法 | 第26-36页 |
| 1.2.1 单颗粒技术 | 第26-31页 |
| 1.2.1.1 基本流程 | 第26-27页 |
| 1.2.1.2 二维投影的对中 | 第27页 |
| 1.2.1.3 二维投影的平均化处理 | 第27-28页 |
| 1.2.1.4 三维结构的计算 | 第28-29页 |
| 1.2.1.5 分辨率评估 | 第29页 |
| 1.2.1.6 单颗粒技术的应用 | 第29-30页 |
| 1.2.1.7 单颗粒技术存在的主要问题及解决 | 第30-31页 |
| 1.2.2 电子断层成像技术 | 第31-36页 |
| 1.2.2.1 电子断层成像技术的基本流程 | 第31-32页 |
| 1.2.2.2 样品制备 | 第32页 |
| 1.2.2.3 图像采集 | 第32-34页 |
| 1.2.2.4 二维投影的三维重构 | 第34页 |
| 1.2.2.5 电子断居成像技术的应用 | 第34-35页 |
| 1.2.2.6 电子断层成像技术目前存在的问题 | 第35-36页 |
| 1.3 二十面体病毒的冷冻电镜研究 | 第36-39页 |
| 1.3.1 二十面体病毒的结构特点 | 第36-37页 |
| 1.3.2 二十面体的取向和中心估算 | 第37-39页 |
| 1.4 正义RNA病毒复制机制研究 | 第39-42页 |
| 1.4.1 单链正义RNA病毒复制场所的形态 | 第39-41页 |
| 1.4.2 RNA依赖性的RNA聚合酶结构及机理 | 第41-42页 |
| 1.5 本论文研究的主要内容和意义 | 第42-45页 |
| 1.5.1 本论文研究的主要内容 | 第42-43页 |
| 1.5.2 本论文选题的意义 | 第43-45页 |
| 2 玉米褪绿斑驳病毒粒子的冷冻电镜三维重构 | 第45-85页 |
| 2.1 前言 | 第45-46页 |
| 2.2 材料和方法 | 第46-55页 |
| 2.2.1 毒源 | 第46页 |
| 2.2.2 试剂和设备 | 第46页 |
| 2.2.2.1 试剂和耗材 | 第46页 |
| 2.2.2.2 仪器和软件 | 第46页 |
| 2.2.3 病毒的摩擦接种 | 第46-47页 |
| 2.2.4 病毒粒子的提纯 | 第47页 |
| 2.2.4.1 病毒粒子初提纯 | 第47页 |
| 2.2.4.2 病毒粒子精细提纯 | 第47页 |
| 2.2.5 提纯病毒样品的电镜负染色观察 | 第47-48页 |
| 2.2.6 冷冻样品的制备 | 第48-50页 |
| 2.2.6.1 冷冻样品的制备 | 第48-49页 |
| 2.2.6.2 冷冻样品的转移 | 第49-50页 |
| 2.2.7 冷冻电镜图像采集 | 第50-52页 |
| 2.2.7.1 冷冻电镜状态的调节 | 第50-51页 |
| 2.2.7.2 冷冻电镜图像的采集 | 第51-52页 |
| 2.2.8 冷冻电镜图像处理 | 第52页 |
| 2.2.9 冷冻电镜三维重构 | 第52-53页 |
| 2.2.10 MCMV氨基酸序列的同源建模 | 第53页 |
| 2.2.11 模型的优化及验证 | 第53-54页 |
| 2.2.12 MCMV衣壳蛋白保守结构域的预测 | 第54页 |
| 2.2.13 结构与序列的下载 | 第54-55页 |
| 2.2.14 氨基酸序列的多序列对比及系统进化树的构建 | 第55页 |
| 2.3 结果 | 第55-80页 |
| 2.3.1 玉米褪绿斑驳病毒的电镜负染色结果 | 第55-56页 |
| 2.3.2 MCMV粒子冷冻电镜照片质量评估 | 第56-57页 |
| 2.3.3 病毒粒子的框选 | 第57页 |
| 2.3.4 病毒粒子的CTF校正 | 第57-59页 |
| 2.3.5 MCMV初始模板的获得 | 第59-60页 |
| 2.3.6 基于获得的初始模板对MCMV重构进行精修 | 第60-63页 |
| 2.3.7 MCMV的三维重构结果 | 第63-74页 |
| 2.3.7.1 MCMV粒子的三维结构 | 第63-64页 |
| 2.3.7.2 MCMV三维重构分辨率的评估 | 第64-66页 |
| 2.3.7.3 不对称单元的亚基组成 | 第66-67页 |
| 2.3.7.4 MCMV模型的建立 | 第67-69页 |
| 2.3.7.5 MCMV重构电子密度图的质量 | 第69页 |
| 2.3.7.6 潜在的钙离子结合位点 | 第69-70页 |
| 2.3.7.7 不对称单元之间的相互作用分析 | 第70-71页 |
| 2.3.7.8 内部核酸结合位点分析 | 第71-73页 |
| 2.3.7.9 表面功能位点分析 | 第73-74页 |
| 2.3.8 基于氨基酸序列进行多序列比对结果分析 | 第74-77页 |
| 2.3.9 基于衣壳蛋白氨基酸序列的进化分析 | 第77-78页 |
| 2.3.10 基于病毒形态结构的分类 | 第78-80页 |
| 2.4 讨论 | 第80-85页 |
| 2.4.1 MCMV粒子的稳定因素 | 第80-82页 |
| 2.4.2 基因组RNA与病毒衣壳的相互作用 | 第82页 |
| 2.4.3 MCMV表面的功能位点分析 | 第82-83页 |
| 2.4.4 MCMV的进化分析 | 第83-85页 |
| 3 麝香石竹斑驳病毒粒子的冷冻电镜三维重构 | 第85-106页 |
| 3.1 前言 | 第85-86页 |
| 3.2 材料与方法 | 第86-90页 |
| 3.2.1 毒源的获得及鉴定 | 第86页 |
| 3.2.2 试剂和设备 | 第86-87页 |
| 3.2.2.1 试剂和耗材 | 第86页 |
| 3.2.2.2 仪器和软件 | 第86-87页 |
| 3.2.3 病毒粒子的提纯及负染色观察 | 第87页 |
| 3.2.4 冷冻样品的制备 | 第87-88页 |
| 3.2.4.1 冷冻样品的制备 | 第87-88页 |
| 3.2.4.2 冷冻样品的转移 | 第88页 |
| 3.2.5 冷冻电镜图像采集 | 第88-90页 |
| 3.2.5.1 冷冻电镜状态的调节 | 第88-89页 |
| 3.2.5.2 冷冻电镜图像的采集 | 第89-90页 |
| 3.2.5.3 冷冻电镜低剂量模式下图像采集 | 第90页 |
| 3.2.6 冷冻电镜图像处理 | 第90页 |
| 3.2.7 冷冻电镜三维重构 | 第90页 |
| 3.3 结果 | 第90-103页 |
| 3.3.1 CarMV粒子的提纯及负染色观察 | 第90-91页 |
| 3.3.2 CarMV粒子冷冻电镜观察结果 | 第91-92页 |
| 3.3.3 CarMV粒子的三维结构 | 第92-94页 |
| 3.3.4 不对称单元内亚基相关性比较 | 第94-95页 |
| 3.3.5 CarMV三维结构的大小比较 | 第95-96页 |
| 3.3.6 分辨率的评估 | 第96-97页 |
| 3.3.7 不对称单元内亚基间相互作用比较 | 第97-100页 |
| 3.3.8 CarMV粒子内部核酸分布分析 | 第100-103页 |
| 3.4 讨论 | 第103-106页 |
| 3.4.1 CarMV冷冻电镜三维重构中的钙离子分布 | 第103页 |
| 3.4.2 CarMV中钙离子的作用 | 第103-104页 |
| 3.4.3 CarMV病毒基因组出壳机制探索 | 第104-106页 |
| 4 玉米褪绿斑驳病毒细胞病理及复制机制电子显微学 | 第106-143页 |
| 4.1 前言 | 第106-107页 |
| 4.2 材料与方法 | 第107-120页 |
| 4.2.1 毒源与植物材料 | 第107页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第107-108页 |
| 4.2.2.1 试剂和耗材 | 第107页 |
| 4.2.2.2 仪器和软件 | 第107-108页 |
| 4.2.3 摩擦接种 | 第108页 |
| 4.2.4 茎杆注射法 | 第108页 |
| 4.2.5 电镜样品的制备 | 第108-110页 |
| 4.2.5.1 常规电镜样品制备方法 | 第108-109页 |
| 4.2.5.2 低温包埋样品制备方法 | 第109页 |
| 4.2.5.3 高压冷冻样品制备方法 | 第109-110页 |
| 4.2.6 免疫胶体金标记 | 第110页 |
| 4.2.7 MCMV复制酶P111的生物信息学分析 | 第110-111页 |
| 4.2.7.1 P111的复制酶跨膜区预测 | 第111页 |
| 4.2.7.2 P111保守结构域预测 | 第111页 |
| 4.2.7.3 P111蛋白的同源建模 | 第111页 |
| 4.2.8 MCMV复制酶特异性抗体制备 | 第111-118页 |
| 4.2.8.1 MCMV复制酶P111片段的克隆及表达 | 第111-113页 |
| 4.2.8.2 含有目的基因的克隆载体构建 | 第113-118页 |
| 4.2.9 电子断层成像技术 | 第118-120页 |
| 4.2.9.1 样品制备 | 第118-119页 |
| 4.2.9.2 TF20透射电镜状态调节 | 第119页 |
| 4.2.9.3 图像采集 | 第119页 |
| 4.2.9.4 数据处理 | 第119-120页 |
| 4.3 结果 | 第120-138页 |
| 4.3.1 P111蛋白C端部分序列的原核表达及蛋白纯化 | 第120-124页 |
| 4.3.2 感染MCMV的田间玉米细胞病理变化 | 第124-125页 |
| 4.3.3 MCMV侵染玉米中过氧化物酶体的病变 | 第125-128页 |
| 4.3.4 MCMV复制酶P111的亚细胞定位分析 | 第128-129页 |
| 4.3.5 MCMV复制中间产物dsRNA亚细胞定位分析 | 第129-130页 |
| 4.3.6 过氧化物酶体复制小泡的电子断层三维重构 | 第130-132页 |
| 4.3.7 相邻过氧化物酶体之间的连接关系 | 第132页 |
| 4.3.8 过氧化物酶体中无定形物质的免疫胶体金标记 | 第132-133页 |
| 4.3.9 病毒粒子在细胞质结晶状聚集体中的取向分布 | 第133-135页 |
| 4.3.10 MCMV侵染对线粒体结构及细胞能量代谢的影响 | 第135-137页 |
| 4.3.11 线粒体病变过程的模型 | 第137-138页 |
| 4.4 讨论 | 第138-143页 |
| 4.4.1 MCMV复制酶的亚细胞定位分析 | 第138-139页 |
| 4.4.2 MCMV的RNA复制场所 | 第139-140页 |
| 4.4.3 病毒因子诱导膜增生的机理 | 第140页 |
| 4.4.4 MCMV组装位点分析 | 第140-141页 |
| 4.4.5 MCMV侵染对线粒体结构的影响 | 第141-143页 |
| 5 全文小结及研究展望 | 第143-145页 |
| 5.1 全文小结 | 第143-144页 |
| 5.2 研究展望 | 第144-145页 |
| 附文1 马铃薯Y病毒粒子胞间运动的电子显微学证据 | 第145-157页 |
| 1.1 前言 | 第145-146页 |
| 1.2 材料与方法 | 第146-147页 |
| 1.2.1 试剂和仪器 | 第146页 |
| 1.2.1.1 试剂和耗材 | 第146页 |
| 1.2.1.2 仪器和设备 | 第146页 |
| 1.2.2 毒源及病毒接种 | 第146页 |
| 1.2.3 透射电镜样品制备 | 第146-147页 |
| 1.2.4 免疫胶体金标记 | 第147页 |
| 1.2.5 电子断层成像技术数据收集及图像处理 | 第147页 |
| 1.2.6 同源建模 | 第147页 |
| 1.3 结果 | 第147-154页 |
| 1.3.1 Potyvirus柱状内含体的形态结构 | 第147-148页 |
| 1.3.2 病毒衣壳蛋白的免疫胶体金标记 | 第148-150页 |
| 1.3.3 柱状内含体促进病毒粒子穿过胞间连丝 | 第150-152页 |
| 1.3.4 CI与病毒衣壳蛋白互作机制 | 第152-154页 |
| 1.4 讨论 | 第154-157页 |
| 1.4.1 病毒粒子与柱状内含体的结合方式 | 第154-155页 |
| 1.4.2 病毒粒子的胞间运输形式 | 第155-156页 |
| 1.4.3 病毒粒子离开Cl潜在动力来源 | 第156-157页 |
| 参考文献 | 第157-177页 |
| 附录A 缩写词及中英文对照 | 第177-179页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第179-183页 |
| 作者简历及其在校期间取得的科研成果 | 第183页 |
