| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 1 前言 | 第12-26页 |
| ·动物抗菌肽简介 | 第12-16页 |
| ·动物防御素的分类 | 第14页 |
| ·动物防御素的分子特征 | 第14-15页 |
| ·动物防御素的分布 | 第15-16页 |
| ·动物β-防御素的特点 | 第16-18页 |
| ·动物β-防御素的一级结构 | 第16-18页 |
| ·动物β-防御素的分布 | 第18页 |
| ·动物β-防御素的抑菌功能 | 第18-21页 |
| ·动物β-防御素抑菌活性 | 第18-19页 |
| ·动物β-防御素的抑菌机制 | 第19-21页 |
| ·动物β-防御素的其它生物活性 | 第21-23页 |
| ·动物β-防御素的免疫调节作用 | 第21-22页 |
| ·动物β-防御素细胞毒作用 | 第22-23页 |
| ·动物β-防御素对癌细胞的作用 | 第23页 |
| ·防御素的应用前景 | 第23-24页 |
| ·代替部分抗生素，从而为解决细菌耐药性问题提供新的方法 | 第23-24页 |
| ·应用于动物转基因工程 | 第24页 |
| ·应用于农业生产 | 第24页 |
| ·本研究的目的意义 | 第24-26页 |
| 2 实验一 蒙古绵羊β-防御素-1（sBD-1）的cDNA 的克隆与序列分析 | 第26-35页 |
| ·材料 | 第26页 |
| ·载体、菌种 | 第26页 |
| ·仪器和试剂 | 第26页 |
| ·方法 | 第26-31页 |
| ·PCR 引物的设计及合成 | 第26页 |
| ·蒙古绵羊十二指肠组织 RNA 的提取及检测 | 第26-27页 |
| ·RT-PCR 反应 | 第27-29页 |
| ·sBD-1 基因cDNA 的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 | 第29-31页 |
| ·RT-PCR 产物cDNA 的序列测定 | 第31页 |
| ·结果 | 第31-34页 |
| ·十二指肠组织总 RNA 的检测结果 | 第31-32页 |
| ·十二指肠组织 RT-PCR 扩增结果 | 第32页 |
| ·sBD-1 基因的克隆与鉴定 | 第32-33页 |
| ·测序结果及序列分析 | 第33页 |
| ·蒙古绵sBD-1 与牛、羊、猪β-防御素氨基酸序列的比较 | 第33-34页 |
| ·讨论 | 第34-35页 |
| 3 实验二 蒙古绵羊β-防御素前原肽及其成熟肽在大肠杆菌中的表达 | 第35-45页 |
| ·材料 | 第35页 |
| ·试验方法 | 第35-39页 |
| ·sBD-1 前原肽及其成熟肽重组原核表达载体的构建 | 第35-37页 |
| ·PET32a-psBD-1 和 PET32a-msBD-1 重组原核表达载体的表达 | 第37-38页 |
| ·表达蛋白的纯化（亲和层析） | 第38页 |
| ·更换酶切缓冲液 | 第38页 |
| ·肠激酶酶切 | 第38页 |
| ·脱盐 | 第38-39页 |
| ·冷冻干燥 | 第39页 |
| ·Trcine-甘油-SDS-PAGE 电泳 | 第39页 |
| ·大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验 | 第39页 |
| ·结果 | 第39-43页 |
| ·目的片段的亚克隆 | 第39-40页 |
| ·PET32a-psBD-1 和 PET32a-msBD-1 的鉴定 | 第40页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE 电泳 | 第40-41页 |
| ·表达蛋白的 Western blot 鉴定 | 第41页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| ·纯化蛋白的酶切及浓缩 | 第42页 |
| ·重组表达的psBD-1 和msBD-1 活性鉴定 | 第42-43页 |
| ·讨论 | 第43-45页 |
| 4 实验三 msBD-1 巴斯德巴斯德毕赤酵母表达中的表达 | 第45-55页 |
| ·材料 | 第45-47页 |
| ·主要材料 | 第45页 |
| ·主要培养基 | 第45-47页 |
| ·试验方法 | 第47-51页 |
| ·编码成熟肽msBD-1 的亚克隆 | 第47页 |
| ·重组表达质粒 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 的构建及鉴定 | 第47-48页 |
| ·msBD-1/msBD-1-T 的线性化 | 第48页 |
| ·msBD-1/msBD-1-T 转入巴斯德毕赤酵母 | 第48-50页 |
| ·筛选Mut+及Muts 转化子 | 第50页 |
| ·Mut+胞内或分泌表达 | 第50-51页 |
| ·Tricine-甘油-SDS-PAGE 电泳和Western Blot 检测 | 第51页 |
| ·结果 | 第51-54页 |
| ·编码成熟肽msBD-1 和msBD-1-T 的亚克隆 | 第51-52页 |
| ·重组表达质粒 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 的构建及鉴定 | 第52-53页 |
| ·筛选Mut+及Muts 转化子 | 第53页 |
| ·Tricine-甘油-SDS-PAGE 电泳和Western Blot 检测 | 第53-54页 |
| ·讨论 | 第54-55页 |
| 5 实验四 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 在毕赤酵母中表达条件的优化 | 第55-60页 |
| ·材料 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-56页 |
| ·最佳诱导时间的选择 | 第55-56页 |
| ·最佳诱导pH 值的选择 | 第56页 |
| ·最佳诱导甲醇浓度的选择 | 第56页 |
| ·Tricine-甘油-SDS-PAGE 电泳 | 第56页 |
| ·结果 | 第56-58页 |
| ·最佳诱导时间 | 第56-57页 |
| ·最佳诱导pH 值 | 第57-58页 |
| ·最佳诱导甲醇浓度 | 第58页 |
| ·讨论 | 第58-60页 |
| 6 实验五 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 在发酵罐水平的表达及其纯化 | 第60-67页 |
| ·材料 | 第60-61页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60-61页 |
| ·方法 | 第61-63页 |
| ·种子液的制备 | 第61页 |
| ·发酵罐使用前的灭菌 | 第61页 |
| ·接种 | 第61页 |
| ·发酵 | 第61-62页 |
| ·发酵产物的纯化 | 第62页 |
| ·表达产物的Trcine-甘油-SDS-PAGE 电泳 | 第62-63页 |
| ·结果 | 第63-65页 |
| ·发酵液上清的电泳 | 第63页 |
| ·Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 在发酵罐水平表达产物的纯化 | 第63-65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| 7 实验六 msBD-1 和msBD-1-T 的活性鉴定及比较 | 第67-82页 |
| ·材料 | 第67页 |
| ·方法 | 第67-70页 |
| ·msBD-1 和msBD-1-T 的抗菌活性 | 第67-68页 |
| ·msBD-1 和msBD-1-T 的免疫诱导作用 | 第68-70页 |
| ·结果 | 第70-79页 |
| ·msBD-1 和msBD-1-T 的抗菌活性 | 第70-74页 |
| ·msBD-1 和msBD-1-T 对293T 细胞CCR6 和 CCL20 表达量的调节作用 | 第74-78页 |
| ·msBD-1 和msBD-1-T 对293T 细胞的免疫趋化作用 | 第78-79页 |
| ·讨论 | 第79-82页 |
| ·绵羊防御素的抗菌活性 | 第79-80页 |
| ·绵羊防御素的化学诱导活性 | 第80-82页 |
| 8 结论 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-97页 |
| 作者简介 | 第97页 |
