| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1 绪论 | 第15-38页 |
| 1.1 手性化合物及其合成 | 第15-19页 |
| 1.1.1 手性化合物 | 第15-16页 |
| 1.1.2 手性化合物的应用 | 第16-17页 |
| 1.1.3 手性化合物的合成 | 第17-19页 |
| 1.2 酶的手性选择性及其改造 | 第19-28页 |
| 1.2.1 酶的手性选择性 | 第19-22页 |
| 1.2.2 酶工程 | 第22-28页 |
| 1.2.3 手性选择性的改造 | 第28页 |
| 1.3 分子模拟 | 第28-31页 |
| 1.3.1 分子模拟简介 | 第28-29页 |
| 1.3.2 常用的分子模拟方法 | 第29-31页 |
| 1.4 酯酶和脱氢酶及其在手性化合物合成中的应用 | 第31-36页 |
| 1.4.1 酯酶 | 第31-34页 |
| 1.4.2 脱氢酶 | 第34-36页 |
| 1.5 本文研究的主要内容 | 第36-38页 |
| 2 利用半理性设计平衡酯酶RspE定向进化中的活性与手性选择性的负相关变化 | 第38-53页 |
| 2.1 实验材料 | 第38-40页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第38-39页 |
| 2.1.2 工具酶 | 第39页 |
| 2.1.3 试剂 | 第39页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第39-40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-45页 |
| 2.2.1 分子对接及结构分析 | 第40-41页 |
| 2.2.2 突变体库的构建 | 第41-43页 |
| 2.2.3 突变体库的筛选 | 第43-44页 |
| 2.2.4 优势突变体的活性测定 | 第44-45页 |
| 2.2.5 代表突变体的动力学常数测定 | 第45页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第45-52页 |
| 2.3.1 结构分析及突变点选定 | 第45-47页 |
| 2.3.2 突变体库的筛选 | 第47-49页 |
| 2.3.3 代表突变体动力学常数的测定 | 第49-50页 |
| 2.3.4 活性选择性负相关现象产生与被平衡的酶反应动力学原因 | 第50-51页 |
| 2.3.5 活性选择性负相关现象产生与被平衡的蛋白工程方法学原因 | 第51-52页 |
| 2.4 小结 | 第52-53页 |
| 3 酯酶RspE活性手性选择性负相关变化现象的分子模拟 | 第53-67页 |
| 3.1 实验方法 | 第53-56页 |
| 3.1.1 蛋白分子结构及突变体构建 | 第53页 |
| 3.1.2 底物分子结构及力场参数确定 | 第53页 |
| 3.1.3 蛋白-底物复合物的构建 | 第53-54页 |
| 3.1.4 分子动力学模拟 | 第54-55页 |
| 3.1.5 模拟结果分析 | 第55-56页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第56-66页 |
| 3.2.1 模拟体系平衡情况分析 | 第56-57页 |
| 3.2.2 反应过渡态有效性分析 | 第57-60页 |
| 3.2.3 功能基组原子的势能分析 | 第60-61页 |
| 3.2.4 口袋基组氨基酸与底物的相互作用能分析 | 第61-62页 |
| 3.2.5 蛋白-小分子复合物的构象分析 | 第62-63页 |
| 3.2.6 突变热点氨基酸对蛋白-底物相互作用的贡献分析 | 第63-65页 |
| 3.2.7 活性与手性选择性负相关变化现象产生与被平衡的分子机理 | 第65-66页 |
| 3.3 本章小结 | 第66-67页 |
| 4 酯酶BioH在对称二酯的不对称水解中的手性选择性的设计 | 第67-81页 |
| 4.1 实验材料 | 第68页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第68页 |
| 4.1.2 酶和试剂 | 第68页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第68页 |
| 4.2 实验方法 | 第68-73页 |
| 4.2.1 3-苯基戊二酸二甲酯的合成 | 第68-69页 |
| 4.2.2 BioH的克隆及突变体的构建 | 第69-70页 |
| 4.2.3 蛋白表达与纯化 | 第70页 |
| 4.2.4 蛋白纯度表征及浓度测定 | 第70页 |
| 4.2.5 3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解 | 第70-71页 |
| 4.2.6 酯酶BioH对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解及产物表征 | 第71页 |
| 4.2.7 分子动力学模拟 | 第71-73页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第73-80页 |
| 4.3.1 酯酶BioH野生型对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解 | 第73-74页 |
| 4.3.2 野生型BioH与底物的结合分析 | 第74-76页 |
| 4.3.3 突变体设计 | 第76页 |
| 4.3.4 酯酶BioH突变体对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解 | 第76-78页 |
| 4.3.5 蛋白-底物复合物的分子模拟 | 第78-80页 |
| 4.4 本章小结 | 第80-81页 |
| 5 酯酶RspE在对称二酯的不对称水解中的手性选择性的设计 | 第81-93页 |
| 5.1 实验材料与方法 | 第81-82页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第82-92页 |
| 5.2.1 酯酶RspE野生型对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解 | 第82-83页 |
| 5.2.2 酯酶RspE野生型与底物的结合分析 | 第83-85页 |
| 5.2.3 突变体设计 | 第85页 |
| 5.2.4 酯酶RspE突变体对3-苯基戊二酸二甲酯的不对称水解 | 第85-87页 |
| 5.2.5 蛋白-底物复合物的分子模拟 | 第87-89页 |
| 5.2.6 酯酶在对称二酯不对称水解反应中手性选择性的来源 | 第89-90页 |
| 5.2.7 手性选择性设计策略讨论 | 第90-92页 |
| 5.3 本章小结 | 第92-93页 |
| 6 D-扁桃酸脱氢酶DMdh对邻氯扁桃酸的活性的设计 | 第93-109页 |
| 6.1 实验材料 | 第94页 |
| 6.1.1 菌株与质粒 | 第94页 |
| 6.1.2 酶和试剂 | 第94页 |
| 6.1.3 主要仪器 | 第94页 |
| 6.2 实验方法 | 第94-98页 |
| 6.2.1 D-扁桃酸脱氢酶DMdh基因的亚克隆 | 第94页 |
| 6.2.2 突变体A89H的构建 | 第94-95页 |
| 6.2.3 蛋白的表达纯化 | 第95页 |
| 6.2.4 蛋白纯度表征及浓度测定 | 第95页 |
| 6.2.5 扁桃酸及邻氯扁桃酸的脱氢氧化 | 第95-96页 |
| 6.2.6 分子动力学模拟 | 第96-98页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第98-108页 |
| 6.3.1 DMdh野生型对扁桃酸及邻氯扁桃酸的脱氢氧化 | 第98-100页 |
| 6.3.2 底物分子结构分析 | 第100-102页 |
| 6.3.3 DMdh野生型的结构及分子动力学模拟 | 第102-105页 |
| 6.3.4 突变体设计及活力测定 | 第105-106页 |
| 6.3.5 突变体的分子动力学模拟 | 第106-108页 |
| 6.4 本章小结 | 第108-109页 |
| 7 结论与展望 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-122页 |
| 附录 用于基因合成的DMdh序列 | 第122-123页 |
| 作者简历 | 第123-124页 |
