| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-17页 |
| 1 引言 | 第17-33页 |
| ·HFMD 的流行病学 | 第17-18页 |
| ·EV71 和CA16 分子生物学性质 | 第18-19页 |
| ·EV71 和CA16 病毒一般性状 | 第18页 |
| ·EV71 和 CA16 病毒基因组结构及编码蛋白 | 第18-19页 |
| ·EV71 和CA16 病毒增殖过程 | 第19页 |
| ·病毒的吸附和脱壳 | 第19页 |
| ·病毒的蛋白加工与 RNA 合成 | 第19页 |
| ·病毒颗粒组装与释放 | 第19页 |
| ·EV71 和CA16 病毒结构及其病原学特征 | 第19-20页 |
| ·HFMD 的致病机理 | 第20-22页 |
| ·微生物学诊断 | 第22页 |
| ·病毒分离及鉴定 | 第22页 |
| ·血清学实验方法诊断 | 第22页 |
| ·RT-PCR、核酸杂交技术 | 第22页 |
| ·HFMD 的药物治疗 | 第22-23页 |
| ·免疫球蛋白 | 第22-23页 |
| ·抗病毒药物 | 第23页 |
| ·预防疫苗研究概况 | 第23-26页 |
| ·灭活全病毒疫苗 | 第23页 |
| ·减毒疫苗 | 第23-24页 |
| ·重组蛋白疫苗 | 第24页 |
| ·载体疫苗 | 第24页 |
| ·核酸疫苗 | 第24-25页 |
| ·转基因植物、动物疫苗 | 第25-26页 |
| ·病毒样颗粒疫苗 | 第26页 |
| ·杆状病毒表达载体 | 第26-32页 |
| ·杆状病毒生物学特性 | 第26-27页 |
| ·杆状病毒表达系统的特点 | 第27-29页 |
| ·杆状病毒昆虫表达系统的组成 | 第29-30页 |
| ·杆状病毒昆虫表达系统的基本原理 | 第30-31页 |
| ·杆状病毒昆虫表达系统技术路线 | 第31-32页 |
| ·本研究的目的意义 | 第32-33页 |
| 2 重组 EV71 VP1 和 CA16 VP1 蛋白疫苗的构建、表达和纯化 | 第33-59页 |
| ·实验材料 | 第33-36页 |
| ·质粒、毒株和细胞 | 第33页 |
| ·分子生物学实验常用试剂 | 第33-34页 |
| ·主要仪器 | 第34页 |
| ·主要溶液配制 | 第34-35页 |
| ·分子生物学分析软件 | 第35-36页 |
| ·实验动物 | 第36页 |
| ·方法 | 第36-51页 |
| ·肠道病毒 EV71 和 CA16 的培养和分离 | 第36-37页 |
| ·提取 EV71 RNA 和 CA16 RNA | 第37页 |
| ·EV71 和CA16 的RT-PCR | 第37页 |
| ·引物设计与合成 | 第37-38页 |
| ·PCR 产物与酶切产物电泳及回收 | 第38-41页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第41-42页 |
| ·连接产物的转化 | 第42页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| ·阳性质粒同源重组 | 第43-45页 |
| ·昆虫细胞 Sf9 培养 | 第45-47页 |
| ·昆虫细胞 Sf9 转染 | 第47页 |
| ·收获重组杆状病毒 | 第47-48页 |
| ·PCR 鉴定重组杆状病毒 | 第48页 |
| ·空斑试验测定病毒效价 | 第48-49页 |
| ·重组杆状病毒的扩增 | 第49页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第49页 |
| ·重组蛋白表达鉴定 | 第49-50页 |
| ·AKTA 纯化仪纯化目的蛋白 | 第50-51页 |
| ·结果 | 第51-57页 |
| ·Vero 细胞培养EV71 和CA16 病毒 | 第51页 |
| ·RT-PCR 扩增EV71 VP1 和CA16 VP1 基因 | 第51-52页 |
| ·目的片段与表达载体连接酶切鉴定 | 第52页 |
| ·同源重组质粒 PCR 鉴定 | 第52-53页 |
| ·分析重组 EV71 VP1 Bacmid DNA 和 CA16 VP1 Bacmid DNA | 第53页 |
| ·重组杆粒转染昆虫细胞 Sf9 | 第53-55页 |
| ·重组杆状病毒空斑试验 | 第55页 |
| ·重组蛋白表达检测 | 第55-56页 |
| ·Ni~(2+)亲和层析纯化表达蛋白 | 第56-57页 |
| ·小结与讨论 | 第57-59页 |
| 3 重组 EV71 VP1 和 CA16 VP1 单价蛋白疫苗免疫效果的评价 | 第59-84页 |
| ·材料 | 第59-60页 |
| ·毒株、细胞和实验动物 | 第59页 |
| ·免疫学实验试剂 | 第59页 |
| ·主要仪器 | 第59-60页 |
| ·主要试剂配制 | 第60页 |
| ·方法 | 第60-65页 |
| ·肠道病毒 EV71 和 CA16 培养 | 第60页 |
| ·EV71 和CA16 病毒滴度测定 | 第60-61页 |
| ·免疫方案 | 第61页 |
| ·检测抗原与佐剂吸附率 | 第61页 |
| ·标本采集 | 第61-62页 |
| ·小鼠血清 IgG 抗体及抗体亚型效价检测 | 第62页 |
| ·小鼠鼻腔、局部小肠灌洗液抗体效价检测 | 第62页 |
| ·小鼠血清中和抗体效价测定及病毒回滴 | 第62-63页 |
| ·脾淋巴细胞悬液的制备 | 第63页 |
| ·流式细胞分析检测 | 第63-64页 |
| ·T 淋巴细胞增殖检测 | 第64页 |
| ·检测特异性sIgA 抗体分泌细胞 | 第64-65页 |
| ·检测脾脏细胞分泌特异性 IFN-γ和 IL-4 | 第65页 |
| ·统计学方法 | 第65页 |
| ·结果 | 第65-80页 |
| ·EV71 和CA16 病毒滴度 | 第65-66页 |
| ·抗原与 AL(OH)3吸附率 | 第66页 |
| ·最佳抗原包被浓度的确定 | 第66-67页 |
| ·最佳免疫抗原剂量的确定 | 第67-68页 |
| ·不同抗原组腹腔免疫小鼠血清 IgG 抗体效价比较 | 第67-68页 |
| ·不同抗原组腹腔免疫小鼠血清中和抗体效价比较 | 第68页 |
| ·重组单价蛋白疫苗体液免疫应答观察 | 第68-71页 |
| ·血清特异性 IgG 抗体效价动态观察 | 第68-69页 |
| ·腹腔组不同部位 IgG 与sIgA 抗体比较 | 第69-70页 |
| ·滴鼻组不同部位 IgG 与sIgA 抗体的比较 | 第70-71页 |
| ·抗体亚型的检测 | 第71页 |
| ·血清特异性中和抗体效价动态观察 | 第71-72页 |
| ·重组单价蛋白疫苗滴鼻免疫小鼠粘膜免疫应答的观察 | 第72-74页 |
| ·ELISPOT 法检测sIgA 抗体分泌细胞方法的建立 | 第72-73页 |
| ·特异性sIgA 抗体分泌细胞的检测 | 第73-74页 |
| ·重组单价蛋白疫苗腹腔免疫小鼠细胞免疫应答的检测 | 第74-80页 |
| ·T 淋巴细胞增殖实验检测 | 第74-75页 |
| ·小鼠 T 淋巴细胞亚群流式细胞分析 | 第75-76页 |
| ·特异性 IFN-γ和IL-4 分泌型细胞方法的建立 | 第76-78页 |
| ·小鼠脾特异性 IFN-γ和 IL-4 分泌细胞的检测 | 第78-80页 |
| ·重组单价蛋白疫苗腹腔免疫后相关性分析 | 第80页 |
| ·小结与讨论 | 第80-84页 |
| 4 EV71 VP1 和CA16 VP1 二价融合蛋白疫苗的制备 | 第84-95页 |
| ·实验材料 | 第84页 |
| ·实验方法 | 第84-88页 |
| ·PCR 引物设计与合成 | 第84页 |
| ·EV71 VP1 基因的扩增 | 第84页 |
| ·EV71 VP1 PCR 产物双酶切及回收 | 第84-85页 |
| ·表达载体双酶切及回收 | 第85页 |
| ·EV71 VP1 基因与表达载体连接 | 第85页 |
| ·工程菌感受态制备、转化及 PCR 鉴定 | 第85页 |
| ·pFastBac HT B-EV71 VP1 质粒提取 | 第85页 |
| ·扩增 CA16 VP1 基因 | 第85-86页 |
| ·重组 pFastBac HT B-EV71 VP1 质粒与 CA16 VP1 PCR 产物双酶切、连接、转化及 PCR 鉴定 | 第86页 |
| ·重组质粒的获得 | 第86页 |
| ·DH10Bac 感受态的制备 | 第86页 |
| ·重组质粒的转化及 PCR 鉴定 | 第86-87页 |
| ·昆虫细胞 Sf9 贴壁(悬浮)培养 | 第87页 |
| ·重组质粒转染贴壁昆虫细胞 Sf9 | 第87页 |
| ·收获重组杆状病毒及提取杆状病毒 DNA PCR 鉴定 | 第87页 |
| ·空斑试验测定重组病毒效价 | 第87页 |
| ·重组二价融合蛋白表达的检测鉴定 | 第87页 |
| ·重组蛋白的 Western-blot 检测 | 第87-88页 |
| ·利用 AKTA 纯化仪纯化二价融合蛋白 | 第88页 |
| ·结果 | 第88-92页 |
| ·PCR 扩增EV71 VP1 及CA16 VP1 基因 | 第88页 |
| ·PCR 鉴定重组pFastBac HT B-EV71 VP1-CA16 VP1 质粒结果 | 第88-89页 |
| ·重组pFastBac HT B -EV71 VP1-CA16 VP1 质粒双酶切鉴定结果 | 第89页 |
| ·同源重组菌落 PCR 结果 | 第89页 |
| ·分析重组 EV71 VP1-CA16 VP1 Bacmid DNA 结果 | 第89-90页 |
| ·转染昆虫细胞 Sf9 的鉴定 | 第90-91页 |
| ·重组 EV71 VP1-CA16 VP1 杆状病毒空斑试验结果 | 第91-92页 |
| ·EV71 VP1-CA16 VP1 蛋白在昆虫细胞Sf9 表达的鉴定 | 第92页 |
| ·小结与讨论 | 第92-95页 |
| 5 EV71 病毒样颗粒疫苗的制备 | 第95-107页 |
| ·实验材料 | 第95页 |
| ·实验方法 | 第95-99页 |
| ·PCR 引物设计与合成 | 第95页 |
| ·扩增 EV71 P1 基因 | 第95页 |
| ·EV71 P1 基因PCR 产物双酶切及回收 | 第95-96页 |
| ·重组pFastBac Dual 质粒、EV71 P1 基因双酶切及回收 | 第96页 |
| ·EV71 P1 基因与供体质粒pFastBac Dual 连接 | 第96页 |
| ·感受态制备、重组pFastBac Dual-EV71 P1 质粒转化及 PCR 鉴定 | 第96页 |
| ·重组pFastBac Dual-EV71 P1 质粒的提取 | 第96页 |
| ·扩增 EV71 3CD 基因 | 第96页 |
| ·重组 pFastBac Dual-EV71 P1 质粒与 EV71 3CD 基因双酶切及回收 | 第96-97页 |
| ·重组 pFastBac Dual-EV71 P1 质粒与 EV71 3CD 基因连接、转化及 PCR 鉴定 | 第97页 |
| ·重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒的提取 | 第97页 |
| ·DH10 Bac 感受的制备 | 第97页 |
| ·重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒的转化 | 第97-98页 |
| ·pFastBac Dual-EV71 P1-3CD 质粒与Bacmid 同源重组及PCR 鉴定 | 第98页 |
| ·分离重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA | 第98页 |
| ·分析重组pFastBac Dual-EV71 P1-3CD Bacmid DNA | 第98页 |
| ·昆虫细胞 Sf9 贴壁(悬浮)培养 | 第98-99页 |
| ·重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA 质粒转染昆虫细胞Sf9 | 第99页 |
| ·收获重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒及 PCR 鉴定 | 第99页 |
| ·空斑试验测定重组 Bac-EV71 P1-3CD 病毒效价及重组杆状病毒的扩增 | 第99页 |
| ·重组 Bac-EV71 P1-3CD 蛋白在昆虫细胞 Sf9 表达的检测鉴定 | 第99页 |
| ·蔗糖密度梯度离心法纯化 EV71 VLPs | 第99页 |
| ·蔗糖浓度的摸索 | 第99页 |
| ·EV71 VLPs 的初步纯化 | 第99页 |
| ·结果 | 第99-105页 |
| ·PCR 扩增EV71 P1 和EV71 3CD 基因 | 第99-100页 |
| ·重组质粒的构建及双酶切鉴定 | 第100-101页 |
| ·同源重组质粒 PCR 鉴定 | 第101页 |
| ·分析重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA | 第101-102页 |
| ·重组 EV71 P1-3CD Bacmid DNA 转染昆虫细胞Sf9 | 第102页 |
| ·重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒 DNA PCR 鉴定 | 第102-103页 |
| ·重组 EV71 P1-3CD 杆状病毒空斑试验 | 第103页 |
| ·IFA 检测重组EV71 P1-3CD 蛋白 | 第103-104页 |
| ·蔗糖密度梯度离心法纯化 EV71 VLPs | 第104页 |
| ·EV71 VLPs 的SDS-PAGE 分析及Western blot 检测 | 第104-105页 |
| ·透射电镜观察 EV71 VLPs 形成 | 第105页 |
| ·小结与讨论 | 第105-107页 |
| 6 全文总结 | 第107-110页 |
| ·制备 HFMD 新型疫苗 | 第107页 |
| ·单价重组蛋白疫苗的制备 | 第107页 |
| ·二价重组融合蛋白疫苗的制备 | 第107页 |
| ·EV71 VLPs 疫苗的制备 | 第107页 |
| ·重组单价蛋白疫苗免疫效果的评价 | 第107-109页 |
| ·重组单价蛋白疫苗体液免疫应答的评价 | 第107-108页 |
| ·重组单价蛋白疫苗细胞免疫应答的评价 | 第108页 |
| ·重组蛋白疫苗粘膜免疫应答的评价 | 第108-109页 |
| ·结论 | 第109-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-118页 |
| 作者简介 | 第118页 |
