| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第17-40页 |
| 1 研究背景简介 | 第17-26页 |
| 1.1 真菌与病原真菌 | 第17-18页 |
| 1.2 烟曲霉简介 | 第18页 |
| 1.3 烟曲霉与侵袭性曲霉病 | 第18-19页 |
| 1.4 主要的抗真菌药及作用机理 | 第19-20页 |
| 1.5 烟曲霉与唑类药物耐药机制 | 第20-21页 |
| 1.6 烟曲霉毒力相关因素 | 第21-26页 |
| 1.6.1 侵袭性酶类 | 第21-22页 |
| 1.6.2 代谢产物 | 第22-23页 |
| 1.6.3 粘附素,生物膜和疏水蛋白 | 第23页 |
| 1.6.4 细胞壁和温度耐受 | 第23-24页 |
| 1.6.5 适应宿主的能力 | 第24页 |
| 1.6.6 营养物合成与离子吸收 | 第24-26页 |
| 1.6.6.1 营养物合成 | 第25页 |
| 1.6.6.2 离子吸收 | 第25-26页 |
| 2 烟曲霉铁离子吸收与平衡调控 | 第26-29页 |
| 2.1 烟曲霉铁离子吸收 | 第26-27页 |
| 2.2 铁离子平衡调控 | 第27-29页 |
| 3 研究内容与技术路线 | 第29-31页 |
| 3.1 研究内容 | 第29-30页 |
| 3.2 技术路线 | 第30-31页 |
| 3.2.1 技术路线1 | 第30页 |
| 3.2.2 技术路线2 | 第30-31页 |
| 参考文献 | 第31-40页 |
| 第二章 烟曲霉转录因子LEUB的功能研究 | 第40-101页 |
| 第一节 LeuB的鉴定 | 第41-50页 |
| 1 材料与方法 | 第41-47页 |
| 1.1 菌株,培养条件与培养基 | 第41-42页 |
| 1.2 引物 | 第42页 |
| 1.2.1 LeuB蛋白表达引物 | 第42页 |
| 1.2.2 EMSA相关引物 | 第42页 |
| 1.3 hapX启动子区MEME分析 | 第42页 |
| 1.4 烟曲霉DNA提取 | 第42-43页 |
| 1.4.1 试剂 | 第42页 |
| 1.4.2 DNA提取步骤 | 第42-43页 |
| 1.5 pET-30a(+)-LeuB表达载体构建 | 第43-45页 |
| 1.5.1 LeuB片段扩增 | 第43页 |
| 1.5.2 分子克隆 | 第43页 |
| 1.5.3 大肠杆菌转化 | 第43-44页 |
| 1.5.4 大肠杆菌克隆鉴定以及质粒提取 | 第44-45页 |
| 1.6 LeuB锌指结构重组表达与纯化 | 第45页 |
| 1.6.1 试剂配方 | 第45页 |
| 1.6.2 重组表达与纯化 | 第45页 |
| 1.7 Cy5标记探针的制备 | 第45-46页 |
| 1.8 SDS-PAGE验证原核表达 | 第46页 |
| 1.8.1 SDS-PAGE胶配置(ml) | 第46页 |
| 1.8.2 试剂配方 | 第46页 |
| 1.9 凝胶阻滞(EMSA) | 第46-47页 |
| 1.9.1 缓冲液配方 | 第46页 |
| 1.9.2 EMSA非变性胶(20 ml) | 第46页 |
| 1.9.3 EMSA电泳 | 第46-47页 |
| 2 实验结果 | 第47-50页 |
| 2.1 hapX启动子保守结构分析 | 第47-48页 |
| 2.2 LeuB Zn(Ⅱ)_2Cys_6结构域重组表达 | 第48-49页 |
| 2.3 LeuB与gdhA和hapX结合实验 | 第49-50页 |
| 3 讨论 | 第50页 |
| 第二节 LeuB参与烟曲霉亮氨酸合成以及铁离子吸收 | 第50-64页 |
| 1 材料与方法 | 第51-59页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第51-52页 |
| 1.1.1 菌株 | 第51页 |
| 1.1.2 培养基 | 第51-52页 |
| 1.2 引物 | 第52-54页 |
| 1.3 菌株构建 | 第54-57页 |
| 1.3.1 敲除载体构建 | 第54-55页 |
| 1.3.2 基因回补载体构建 | 第55-56页 |
| 1.3.3 高调载体构建 | 第56-57页 |
| 1.4 烟曲霉转化 | 第57-58页 |
| 1.4.1 转化试剂 | 第57页 |
| 1.4.2 转化步骤 | 第57-58页 |
| 1.5 平板点菌实验 | 第58-59页 |
| 1.5.1 培养基配制 | 第58页 |
| 1.5.2 孢子计数与点菌 | 第58-59页 |
| 2 实验结果 | 第59-63页 |
| 2.1 烟曲霉LeuB参与亮氨酸的合成 | 第59页 |
| 2.2 LeuB参与烟曲霉铁离子吸收 | 第59-61页 |
| 2.3 其他离子不能恢复ΔleuB的病态表型 | 第61页 |
| 2.4 构巢曲霉LeuB敲除菌对铁敏感性测定 | 第61页 |
| 2.5 LeuB及其可能的同源基因LeuB1,LeuB2的功能验证 | 第61-62页 |
| 2.6 LeuB与SreA,HapX双敲菌的表型测试 | 第62-63页 |
| 3 讨论 | 第63-64页 |
| 第三节 LeuB的表达和定位 | 第64-70页 |
| 1 材料与方法 | 第64-69页 |
| 1.1 菌株 | 第64页 |
| 1.2 培养条件 | 第64页 |
| 1.3 引物 | 第64-65页 |
| 1.4 菌株构建 | 第65-66页 |
| 1.4.1 LeuB~(GFP)菌株构建 | 第65页 |
| 1.4.2 LeuB~(GFP,RFP-NLS)菌株构建 | 第65-66页 |
| 1.5 RNA提取与定量PCR | 第66-67页 |
| 1.5.1 曲霉RNA提取 | 第66-67页 |
| 1.5.2 cDNA合成 | 第67页 |
| 1.5.3 定量PCR | 第67页 |
| 1.5.3.1 qPCR反应体系 | 第67页 |
| 1.5.3.2 qPCR反应程序(两步法) | 第67页 |
| 1.6 Western blot | 第67-68页 |
| 1.6.1 试剂配方 | 第67-68页 |
| 1.6.2 蛋白提取步骤 | 第68页 |
| 1.6.3 Western blot步骤 | 第68页 |
| 1.7 显微观察 | 第68-69页 |
| 2 实验结果 | 第69-70页 |
| 2.1 qRT-PCR和Western blot检测LeuB在不同铁浓度下的表达 | 第69页 |
| 2.2 LeuB-GFP的定位 | 第69-70页 |
| 3 讨论 | 第70页 |
| 第四节 LeuB缺失影响了铁载体的合成 | 第70-75页 |
| 1 材料与方法 | 第70-73页 |
| 1.1 菌株 | 第70-71页 |
| 1.2 RNA提取以及定量PCR | 第71页 |
| 1.3 LacZ报告基因相关菌株构建 | 第71页 |
| 1.4 β-Galactosidase实验 | 第71-72页 |
| 1.4.1 试剂配置 | 第71页 |
| 1.4.2 具体步骤 | 第71-72页 |
| 1.5 铁载体TAFC含量测定 | 第72页 |
| 1.6 引物 | 第72-73页 |
| 2 实验结果 | 第73-75页 |
| 2.1 qRT-PCR和LacZ检测hapX的转录 | 第73-74页 |
| 2.2 铁载体合成相关基因表达检测 | 第74页 |
| 2.3 铁载体TAFC含量检测 | 第74-75页 |
| 3 讨论 | 第75页 |
| 第五节 LeuB的缺失加速了HapX蛋白的降解 | 第75-79页 |
| 1 材料与方法 | 第76-77页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第76页 |
| 1.2 菌株构建 | 第76页 |
| 1.3 引物 | 第76-77页 |
| 1.4 Western blot | 第77页 |
| 2 实验结果 | 第77-79页 |
| 2.1 野生型中HapX-GFP荧光和蛋白检测 | 第77-78页 |
| 2.2 LeuB缺失菌中HapX的蛋白检测 | 第78-79页 |
| 3 讨论 | 第79页 |
| 第六节 LeuB的功能依赖于Zn(Ⅱ)_2Cys_6结构 | 第79-84页 |
| 1 材料与方法 | 第80-82页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第80页 |
| 1.2 引物 | 第80-81页 |
| 1.3 菌株构建 | 第81-82页 |
| 1.3.1 位点突变载体构建 | 第81页 |
| 1.3.2 Truncation cassette构建 | 第81页 |
| 1.3.3 位点突变菌以及Truncation菌株转化 | 第81-82页 |
| 2 实验结果 | 第82-83页 |
| 2.1 位点突变菌的表型测定以及HapX稳定性检测 | 第82页 |
| 2.2 C端truncation突变菌的表型测定以及HapX稳定性检测 | 第82-83页 |
| 3 讨论 | 第83-84页 |
| 第七节 LeuB缺失导致细胞蛋白普遍性降解 | 第84-87页 |
| 1 材料与方法 | 第84-85页 |
| 1.1 菌株 | 第84页 |
| 1.2 培养条件 | 第84页 |
| 1.3 考马斯亮蓝染色和Western blot | 第84页 |
| 1.4 TCA (Trichloroacetic acid)法提取蛋白 | 第84-85页 |
| 1.4.1 试剂配方 | 第84页 |
| 1.4.2 提取步骤 | 第84-85页 |
| 2 实验结果 | 第85-86页 |
| 2.1 Actin和GpdA蛋白检测 | 第85页 |
| 2.2 考马斯亮蓝染色 | 第85页 |
| 2.3 leuB缺失导致的蛋白降解主要发生在体外 | 第85-86页 |
| 3 讨论 | 第86-87页 |
| 第八节 LeuB缺失导致的蛋白降解部分依赖蛋白酶体介导的蛋白降解途径 | 第87-90页 |
| 1 材料与方法 | 第87-88页 |
| 1.1 菌株 | 第87页 |
| 1.2 培养条件 | 第87页 |
| 1.3 蛋白提取和Western blot | 第87-88页 |
| 2 实验结果 | 第88-89页 |
| 2.1 leuB缺失导致了蛋白酶体亚基转录高调 | 第88页 |
| 2.2 蛋白酶体抑制剂MG132能够恢复leuB缺失导致的蛋白降解 | 第88-89页 |
| 3 讨论 | 第89-90页 |
| 第九节 LeuB缺失导致的蛋白降解可以通过外加铁离子或者亮氨酸恢复 | 第90-91页 |
| 1 材料与方法 | 第90页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第90页 |
| 1.2 培养条件 | 第90页 |
| 1.3 Western blot | 第90页 |
| 2 实验结果 | 第90-91页 |
| 2.1 铁或者亮氨酸均能恢复leuB缺失导致的蛋白降解 | 第90-91页 |
| 3 讨论 | 第91页 |
| 第十节 亮氨酸的合成对于蛋白的稳定是必需的 | 第91-95页 |
| 1 材料与方法 | 第92-93页 |
| 1.1 菌株 | 第92页 |
| 1.2 培养条件 | 第92页 |
| 1.3 引物 | 第92-93页 |
| 1.4 菌株构建,定量PCR,Western blot | 第93页 |
| 2 实验结果 | 第93-94页 |
| 2.1 野生型和leuB缺失菌中leuA转录水平检测 | 第93页 |
| 2.2 leuA缺失导致的蛋白降解是亮氨酸依赖的 | 第93-94页 |
| 2.3 leuA缺失导致的蛋白降解不能通过外加铁恢复 | 第94页 |
| 3 讨论 | 第94-95页 |
| 第十一节 LeuB缺失部分降低了烟曲霉的毒性 | 第95-98页 |
| 1 材料与方法 | 第95-96页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第95页 |
| 1.2 毒性实验 | 第95页 |
| 1.3 病理切片制作 | 第95-96页 |
| 2 实验结果 | 第96-97页 |
| 2.1 肺部侵染法测定毒性 | 第96页 |
| 2.2 尾静脉注射法测定毒性 | 第96-97页 |
| 3 讨论 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-101页 |
| 第三章 烟曲霉线粒体铁离子通道MRSA的功能研究 | 第101-132页 |
| 第一节 烟曲霉MrsA生物信息学分析 | 第102-105页 |
| 1 材料方法 | 第102页 |
| 1.1 MrsA及其同源蛋白的生物信息学分析 | 第102页 |
| 2 结果 | 第102-104页 |
| 2.1 烟曲霉中ScMrs3/4同源基因的鉴定 | 第102-103页 |
| 2.2 真菌与动植物中MrsA的序列分析 | 第103页 |
| 2.3 致病真菌中MrsA的进化分析 | 第103-104页 |
| 3 讨论 | 第104-105页 |
| 第二节 MrsA是一个烟曲霉线粒体铁通道 | 第105-111页 |
| 1 材料方法 | 第105-107页 |
| 1.1 菌株 | 第105页 |
| 1.2 培养条件 | 第105页 |
| 1.3 引物 | 第105-106页 |
| 1.4 菌株构建 | 第106-107页 |
| 1.5 线粒体染色 | 第107页 |
| 1.6 菌落直径统计 | 第107页 |
| 2 结果 | 第107-110页 |
| 2.1 MrsA定位以及表达分析 | 第107-108页 |
| 2.2 MrsA的敲除以及验证 | 第108-109页 |
| 2.3 MrsA敲除菌表型分析以及同源互补实验 | 第109-110页 |
| 3 讨论 | 第110-111页 |
| 第三节 MrsA参与了烟曲霉中铁离子吸收调控 | 第111-114页 |
| 1 材料方法 | 第111-112页 |
| 1.1 菌株 | 第111页 |
| 1.2 RNA的提取与定量PCR | 第111页 |
| 1.3 引物 | 第111-112页 |
| 2 结果 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-114页 |
| 第四节 MrsA的缺失增加了烟曲霉对氧化应激的敏感性 | 第114-116页 |
| 1 材料方法 | 第114页 |
| 1.1 菌株和培养条件 | 第114页 |
| 1.2 活性氧ROS检测方法 | 第114页 |
| 2 结果 | 第114-116页 |
| 2.1 mrsA缺失菌对过氧化氢以及甲萘醌的敏感性测试 | 第114-115页 |
| 2.2 mrsA缺失会导致ROS产生水平升高 | 第115-116页 |
| 2.3 维生素C能恢复ΔmrsA在氧化应激环境下的表型 | 第116页 |
| 3 讨论 | 第116页 |
| 第五节 MrsA的缺失增加了烟曲霉对唑类药物伊曲康唑的敏感性 | 第116-121页 |
| 1 材料与方法 | 第117-118页 |
| 1.1 菌株和培养基 | 第117页 |
| 1.2 E-test实验 | 第117页 |
| 1.3 麦角固醇提取及分析 | 第117页 |
| 1.4 药物外排泵活力检测 | 第117-118页 |
| 1.5 胞内伊曲康唑滞留量检测 | 第118页 |
| 2 结果 | 第118-121页 |
| 2.1 mrsA缺失显著提升了烟曲霉对伊曲康唑的敏感性 | 第118-120页 |
| 2.2 ΔmrsA中ROS的积累提升了其对伊曲康唑的敏感性 | 第120-121页 |
| 3 讨论 | 第121页 |
| 第六节 MrsA中三个保守的组氨酸是MrsA功能所必需的 | 第121-125页 |
| 1 材料和方法 | 第122-123页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第122页 |
| 1.2 引物 | 第122页 |
| 1.3 位点突变菌株的构建 | 第122-123页 |
| 2 结果 | 第123-125页 |
| 2.1 MrsA三个保守的组氨酸位点是烟曲霉应对低铁和高铁环境所必需的 | 第123页 |
| 2.2 MrsA三个保守的组氨酸位点是烟曲霉应对氧化应激以及唑类药物压力所必需的 | 第123-125页 |
| 3 讨论 | 第125页 |
| 第七节 MrsA的缺失降低了烟曲霉的毒性 | 第125-127页 |
| 1 材料和方法 | 第125-126页 |
| 1.1 菌株和培养条件 | 第125页 |
| 1.2 小鼠毒力实验 | 第125-126页 |
| 2 结果 | 第126-127页 |
| 2.1 MrsA缺失显著降低了烟曲霉的毒力 | 第126-127页 |
| 3 讨论 | 第127页 |
| 参考文献 | 第127-132页 |
| 第四章 全文总结与展望 | 第132-134页 |
| 附录一: 本研究中所用的主要仪器 | 第134-135页 |
| 附录二: 本研究中采用的主要试剂 | 第135-137页 |
| 在读期间发表以及待发表的学术论文 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
