| 摘要 | 第10-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第一篇 文献综述 | 第13-37页 |
| 第一章 猪链球菌病及猪链球菌2型概述 | 第13-25页 |
| 1 前言 | 第13页 |
| 2 病原学 | 第13-14页 |
| 3 流行病学 | 第14-15页 |
| 4 临床症状和病理变化 | 第15页 |
| 4.1 临床症状 | 第15页 |
| 4.2 病理变化 | 第15页 |
| 5 致病机理 | 第15-16页 |
| 6 毒力因子 | 第16-18页 |
| 6.1 荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS) | 第16页 |
| 6.2 溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)和胞外因子(Extracellularfactorprotein,EF) | 第16-17页 |
| 6.3 猪溶血素(Suilysin,SLY) | 第17页 |
| 6.4 其他 | 第17-18页 |
| 7 治疗及转归 | 第18-20页 |
| 7.1 药物治疗 | 第18页 |
| 7.2 疫苗 | 第18-20页 |
| 参考文献 | 第20-25页 |
| 第二章 PTX3蛋白的研究进展 | 第25-37页 |
| 1 简介 | 第25页 |
| 2 正五聚蛋白家族 | 第25-26页 |
| 3 PTX3的基因组成和蛋白表达的调节 | 第26-27页 |
| 4 PTX3在先天性免疫和炎症反应中的作用 | 第27-29页 |
| 4.1 PTX3与补体的相互作用 | 第27页 |
| 4.2 PTX3识别病原体以及对炎症反应的影响 | 第27-28页 |
| 4.3 PTX3对无菌炎症的影响和作用 | 第28-29页 |
| 5 自我修饰与识别 | 第29-30页 |
| 6 PTX3在感染性疾病上的诊断和预后潜力 | 第30-31页 |
| 参考文献 | 第31-37页 |
| 第二篇 研究内容 | 第37-101页 |
| 第一章 猪源PTX3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第37-51页 |
| 1 材料和方法 | 第38页 |
| 1.1 质粒和试剂 | 第38页 |
| 1.2 试验器材 | 第38页 |
| 1.3 试验动物 | 第38页 |
| 2 试验方法 | 第38-43页 |
| 2.1 PTX3蛋白原核表达基因的扩增 | 第38-39页 |
| 2.1.1 引物的设计及合成 | 第38-39页 |
| 2.1.2 PCR反应 | 第39页 |
| 2.2 猪源PIX3蛋白原核基因的克隆 | 第39-40页 |
| 2.2.1 PCR产物的回收和纯化 | 第39页 |
| 2.2.2 质粒PET-32a的扩增及提取 | 第39页 |
| 2.2.3 PCR产物的酶切 | 第39页 |
| 2.2.4 质粒PET-32a的酶切 | 第39-40页 |
| 2.3 重组原核表达质粒PET-32a-ptx3的构建 | 第40页 |
| 2.3.1 重组质粒的连接 | 第40页 |
| 2.3.2 重组质粒转化BL21感受态细胞 | 第40页 |
| 2.4 重组质粒PET-32a-ptx3的鉴定 | 第40-41页 |
| 2.4.1 重组质粒的PCR鉴定 | 第40页 |
| 2.4.2 重组质粒的小量提取以及酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 2.5 重组质粒PET-32a-ptx3的基因序列测定 | 第41页 |
| 2.6 ptx3基因在BL21中的诱导表达和检测 | 第41页 |
| 2.7 原核表达猪源PTX3蛋白的可溶性检测 | 第41页 |
| 2.8 原核表达猪源PTX3蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| 2.8.1 原核表达猪源PTX3包涵体的制备 | 第41页 |
| 2.8.2 原核表达猪源PTX3蛋白的His-Ni-NTA亲和层析纯化 | 第41-42页 |
| 2.9 原核表达猪源PTX3蛋白包涵体的复性 | 第42页 |
| 2.10 原核表达猪源PTX3蛋白多克隆兔抗血清的制备 | 第42页 |
| 2.11 ELISA检测原核表达猪源PTX3蛋白抗血清效价 | 第42-43页 |
| 2.11.1 原核表达猪源PTX3蛋白最佳包被浓度的确定 | 第42-43页 |
| 2.11.2 ELISA检测原核表达猪源PTX3蛋白的抗血清效价 | 第43页 |
| 3 结果 | 第43-48页 |
| 3.1 ptx3原核表达基因的PCR扩增结果 | 第43-44页 |
| 3.2 PCR筛选阳性菌株 | 第44页 |
| 3.3 重组质粒PET-32a-ptx3双酶切鉴定结果 | 第44-45页 |
| 3.4 重组质粒PET-32a-ptx3的测序结果 | 第45-46页 |
| 3.5 重组质粒PET-32a-ptx3在BL21中的表达鉴定 | 第46页 |
| 3.6 原核表达猪源PTX3蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定 | 第46-47页 |
| 3.7 原核表达猪源PTX3蛋白最佳包被浓度的确定 | 第47-48页 |
| 3.8 原核表达pTX3蛋白兔抗血清效价的ELISA检测 | 第48页 |
| 4 讨论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-51页 |
| 第二章 猪源PTX3蛋白真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 | 第51-69页 |
| 1 材料和试剂 | 第52-53页 |
| 1.1 细胞与培养条件 | 第52页 |
| 1.2 质粒和试剂 | 第52页 |
| 1.3 仪器 | 第52-53页 |
| 2 试验方法 | 第53-59页 |
| 2.1 PTX3真核表达基因片段的扩增 | 第53页 |
| 2.1.1 引物的设计与合成 | 第53页 |
| 2.1.2 PCR反应 | 第53页 |
| 2.2 猪源PTX3蛋白真核表达基因的克隆 | 第53-54页 |
| 2.2.1 PCR产物的回收和纯化 | 第53页 |
| 2.2.2 质粒pIRES-EGFP的扩增及提取 | 第53页 |
| 2.2.3 PCR产物的酶切 | 第53-54页 |
| 2.2.4 质粒pIRES-EGFP的酶切 | 第54页 |
| 2.3 重组真核表达质粒pIRES-EGFP-ptx3的构建 | 第54页 |
| 2.3.1 重组质粒的连接 | 第54页 |
| 2.3.2 重组质粒转化DH5α感受态细胞 | 第54页 |
| 2.4 重组质粒pIRES-EGFP-ptx3的鉴定 | 第54-55页 |
| 2.4.1 重组质粒的PCR鉴定 | 第54页 |
| 2.4.2 重组质粒的小量提取以及酶切鉴定 | 第54-55页 |
| 2.5 重组质粒pIRES-EGFP-ptx3的基因序列测定 | 第55页 |
| 2.6 G418最佳筛选浓度的确定 | 第55页 |
| 2.7 重组真核表达质粒pIRES-EGFP-ptx3转染CHO细胞 | 第55-56页 |
| 2.7.1 真核表达载体转染前CHO细胞的预处理 | 第55页 |
| 2.7.2 转染前真核表达载体的预处理 | 第55页 |
| 2.7.3 真核表达载体的转染过程 | 第55-56页 |
| 2.8 G418对转染后稳定单克隆细胞株的筛选 | 第56-57页 |
| 2.8.1 转染后阳性克隆的筛选 | 第56页 |
| 2.8.2 细胞克隆的挑选 | 第56页 |
| 2.8.3 单克隆细胞株的筛选 | 第56-57页 |
| 2.8.4 单克隆细胞株稳定性检测 | 第57页 |
| 2.9 单克隆细胞株中ptx3基因的转录与表达检测 | 第57-58页 |
| 2.9.1 RT-PCR检测单克隆细胞株中ptx3基因的转录 | 第57页 |
| 2.9.1.1 Trizol法提取各单克隆细胞株总RNA | 第57页 |
| 2.9.1.2 cDNA的合成 | 第57页 |
| 2.9.2 Western-blot检测单克隆细胞株中ptx3基因的表达 | 第57-58页 |
| 2.9.2.1 细胞总蛋白的提取 | 第57-58页 |
| 2.9.2.2 SDS-PAGE和Western Blot鉴定 | 第58页 |
| 2.10 CHO-pIRES-EGFP-ptx3单克隆细胞株的扩大培养与表达上清的收集 | 第58页 |
| 2.11 单克隆细胞上清收集液的浓缩和纯化 | 第58-59页 |
| 2.12 猪源PTX3蛋白纯化后的鉴定 | 第59页 |
| 3 结果 | 第59-64页 |
| 3.1 ptx3真核表达基因的PCR扩增结果 | 第59页 |
| 3.2 PCR筛选阳性重组菌株 | 第59-60页 |
| 3.3 重组质粒pIRES-EGFP-ptx3双酶切鉴定 | 第60页 |
| 3.4 重组质粒pIRES-EGFP-ptx3的测序结果 | 第60-61页 |
| 3.5 G418最佳筛选浓度的确定 | 第61-62页 |
| 3.6 重组真核表达载体pIRES-EGFP-ptx3转染CHO细胞 | 第62页 |
| 3.7 单克隆细胞株CHO- pIRES-EGFP-ptx3的荧光显微镜检测 | 第62-63页 |
| 3.8 RT-PCR对阳性单克隆细胞株ptx3基因转录水平的检测 | 第63页 |
| 3.9 单克隆细胞株ptx3基因表达鉴定 | 第63-64页 |
| 3.10 猪源PTX3蛋白纯化后鉴定 | 第64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-69页 |
| 第三章 猪源PTX3蛋白真核表达载体pVAX-ptx3的构建及其在BALB/c小鼠体内的分布 | 第69-81页 |
| 1 材料和试剂 | 第69-70页 |
| 1.1 动物与细胞 | 第69-70页 |
| 1.2 质粒和试剂 | 第70页 |
| 1.3 仪器 | 第70页 |
| 2 试验方法 | 第70-73页 |
| 2.1 ptx3 CDS序列的扩增 | 第70-71页 |
| 2.1.1 引物的设计与合成 | 第70页 |
| 2.1.2 PCR反应 | 第70-71页 |
| 2.2 猪源PTX3蛋白真核表达基因的克隆 | 第71页 |
| 2.2.1 PCR产物的回收和纯化 | 第71页 |
| 2.2.2 质粒pVAX1的扩增及提取 | 第71页 |
| 2.2.3 PCR产物的双酶切 | 第71页 |
| 2.2.4 质粒pVAX 1的双酶切 | 第71页 |
| 2.3 重组真核表达质粒pVAX-ptx3的构建 | 第71-72页 |
| 2.3.1 重组质粒的连接 | 第71页 |
| 2.3.2 重组质粒转化DH5α感受态细胞 | 第71-72页 |
| 2.4 重组质粒pVAX-ptx3的鉴定 | 第72页 |
| 2.4.1 重组质粒的PCR鉴定 | 第72页 |
| 2.4.2 重组质粒的小量提取以及酶切鉴定 | 第72页 |
| 2.5 重组质粒pVAX-ptx3的基因序列测定 | 第72页 |
| 2.6 重组质粒pVAX-ptx3在CHO细胞中的表达与检测 | 第72-73页 |
| 2.6.1 RT-PCR检测pVAX-ptx3在CHO细胞中的转录 | 第72页 |
| 2.6.2 Western blot及间接免疫荧光法检测pVAX-ptx3在CHO细胞中的表达 | 第72-73页 |
| 2.7 重组质粒pVAX-ptx3在小鼠体内的表达与分布检测 | 第73页 |
| 3 试验结果 | 第73-78页 |
| 3.1 阳性重组菌株的PCR筛选 | 第73页 |
| 3.2 重组真核表达质粒pVAX- ptx3双酶切鉴定 | 第73-74页 |
| 3.3 重组真核表达质粒pVAX- ptx3基因测序结果 | 第74-75页 |
| 3.4 重组真核表达质粒pVAX- ptx3转染CHO细胞 | 第75-77页 |
| 3.4.1 RT-PCR检测ptx3基因的转录情况 | 第75页 |
| 3.4.2 Western Blot检测ptx3基因的表达情况 | 第75-76页 |
| 3.4.3 间接免疫荧光法鉴定ptx3基因的表达情况 | 第76-77页 |
| 3.5 重组真核表达质粒pVAX- ptx3在小鼠体内的分布与表达 | 第77-78页 |
| 3.5.1 pVAX-ptx3在小鼠体内的转录与分布 | 第77页 |
| 3.5.2 pVAX-ptx3在小鼠血液内的表达与分布 | 第77-78页 |
| 4 讨论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 第四章 猪源PTX3蛋白及pVAX-ptx3对猪链球菌2型的抗菌作用研究 | 第81-101页 |
| 1 材料与试剂 | 第82-83页 |
| 1.1 菌株与培养条件 | 第82页 |
| 1.2 细胞和培养条件 | 第82页 |
| 1.3 试验动物 | 第82-83页 |
| 1.4 试验试剂与仪器 | 第83页 |
| 2 试验方法 | 第83-85页 |
| 2.1 猪源PTX3蛋白的体外抗菌试验 | 第83页 |
| 2.2 PTX3蛋白对猪肺泡巨噬细胞吞噬能力的调节 | 第83页 |
| 2.3 PTX3蛋白对猪链球菌2型粘附Hep-2细胞的抑制 | 第83-84页 |
| 2.4 pVAX-ptx3在小鼠模型中的抗菌作用 | 第84页 |
| 2.4.1 pVAX-ptx3作用下猪链球菌2型感染BALB/c小鼠组织活菌测定 | 第84页 |
| 2.4.2 pVAX-ptx3作用下对BALB/c小鼠的攻毒试验 | 第84页 |
| 2.5 pVAX-ptx3在仔猪模型中的抗菌作用 | 第84-85页 |
| 2.5.1 pVAX-ptx3作用下仔猪外周血活菌量的变化 | 第84页 |
| 2.5.2 pVAX-ptx3作用下仔猪外周血血液指标的变化 | 第84-85页 |
| 3 结果 | 第85-94页 |
| 3.1 猪源PTX3蛋白的体外抗菌作用 | 第85-86页 |
| 3.2 猪源PTX3蛋白促进猪肺泡巨噬细胞对猪链球菌2型的吞噬能力 | 第86-87页 |
| 3.3 猪源PTX3蛋白抑制猪链球菌2型对Hep-2细胞的粘附 | 第87-88页 |
| 3.4 pVAX-px3对感染S.suis2的BALB/c小鼠的保护力试验 | 第88-91页 |
| 3.4.1 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 HA9801的BALB/c小鼠活菌组织分布结果 | 第88页 |
| 3.4.2 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 ZY05719的BALB/c小鼠活菌组织分布结果 | 第88-89页 |
| 3.4.3 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 P1/7的BALB/c小鼠活菌组织分布结果 | 第89页 |
| 3.4.4 pVAX-ptx3作用下对BALB/c小鼠的攻毒保护试验 | 第89-91页 |
| 3.5 pVAX-ptx3对感染S.suis2 HA9801仔猪的保护力研究 | 第91-94页 |
| 3.5.1 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 HA9801仔猪外周血载菌量分布变化 | 第91-92页 |
| 3.5.2 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 HA9801仔猪外周血炎性因子的变化 | 第92-93页 |
| 3.5.2.1 pVAX-ptx3作用下感染S.suis 2 HA9801仔猪外周血IL-6的变化 | 第92页 |
| 3.5.2.2 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 HA9801仔猪外周血IL-8的变化 | 第92-93页 |
| 3.5.3 pVAX-ptx3作用下感染S.suis2 HA9801仔猪外周血血常规的变化 | 第93-94页 |
| 4 讨论 | 第94-97页 |
| 参考文献 | 第97-101页 |
| 全文总结 | 第101-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
