| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 缩略词表 | 第9-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-25页 |
| ·乳腺上皮细胞研究史简述 | 第13-19页 |
| ·乳腺上皮细胞的原代培养 | 第13-14页 |
| ·乳腺上皮细胞的纯化 | 第14页 |
| ·乳腺反应器的研究进展 | 第14-15页 |
| ·褪黑素及其生理功能 | 第15-18页 |
| ·崂山奶山羊简介 | 第18页 |
| ·褪黑素功能乳的发展现状与前景 | 第18-19页 |
| ·转基因动物技术的研究与应用 | 第19-25页 |
| ·转基因动物的研究 | 第19-22页 |
| ·转基因动物的应用 | 第22-23页 |
| ·转基因动物的安全性 | 第23页 |
| ·研究目的与意义 | 第23-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-44页 |
| ·褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和载体构建的材料与方法 | 第25-35页 |
| ·松果体及质粒来源 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25-26页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第26页 |
| ·实验设计 | 第26页 |
| ·松果体总RNA的提取 | 第26-27页 |
| ·RNA反转录 | 第27-28页 |
| ·AANAT、HIOMT基因片段扩增 | 第28-29页 |
| ·目的片段连接转化至pMD~(TM)19-T载体 | 第29-30页 |
| ·阳性克隆pMD~(TM)19-T-AANAT及pMD~(TM)19-T-HIOMT质粒提取及检测 | 第30页 |
| ·构建表达载体pBC1-AANAT与pBC1-HIOMT | 第30-31页 |
| ·质粒pBC1-AANAT/HIOMT及质粒pcDNA3.1-myc-his的纯化 | 第31页 |
| ·质粒pcDNA3.1-myc-his Neo元件模板扩增及回收 | 第31-33页 |
| ·Neo元件模板PCR产物和载体酶切,连接 | 第33-34页 |
| ·连接产物转化Top 10化学感受态细胞 | 第34页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鉴定 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鉴定 | 第35页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞培养的材料与方法 | 第35-39页 |
| ·组织来源 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35-36页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第36-37页 |
| ·乳腺组织的取材 | 第37页 |
| ·乳腺上皮细胞纯化 | 第37-38页 |
| ·乳腺上皮细胞传代培养 | 第38页 |
| ·乳腺上皮细胞的冻存和解冻培养 | 第38页 |
| ·乳腺上皮细胞生长曲线测定 | 第38-39页 |
| ·转褪黑素合成酶基因乳腺上皮细胞功能验证的材料与方法 | 第39-44页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞株和菌株来源 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第39页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空载体pBC1和pIRES2-EGFP的纯化 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空载体pBC1和pIRES2-EGFP浓度测定 | 第40页 |
| ·脂质体介导的外源基因转染山羊乳腺上皮细胞 | 第40页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第40-41页 |
| ·RNA反转录 | 第41-42页 |
| ·Real Time PCR | 第42-43页 |
| ·数据统计分析 | 第43页 |
| ·细胞培养液中褪黑素浓度测定 | 第43页 |
| ·实验设计 | 第43-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-57页 |
| ·褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和载体构建结果 | 第44-51页 |
| ·褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆结果 | 第44-45页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT与pBC1-HIOMT测序结果 | 第45-48页 |
| ·Neo元件模板扩增结果 | 第48页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鉴定 | 第48-49页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo图谱 | 第50-51页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞培养的结果 | 第51-53页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞的生长特性 | 第51-53页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞生长曲线 | 第53页 |
| ·转褪黑素合成酶基因乳腺上皮细胞功能验证的结果 | 第53-57页 |
| ·重组质粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空载体pBC1和pIRES2-EGFP的纯化 | 第53-54页 |
| ·空载体pIRES2-EGFP转染崂山奶山羊乳腺上皮细胞验证 | 第54页 |
| ·转基因AANAT、HIOMT在崂山奶山羊乳腺上皮细胞中的表达 | 第54-56页 |
| ·转基因崂山奶山羊乳腺上皮细胞合成褪黑素检测 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| ·褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆 | 第57页 |
| ·载体pBC1-AANAT-NEO和PBC1-HIOMT-NEO的乳腺特异性表达 | 第57-58页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞的培养 | 第58-59页 |
| ·崂山奶山羊乳腺上皮细胞转染特异性表达载体PBC1-AANAT和PBC1-HIOMT | 第59-61页 |
| 5 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
