| 目录 | 第1-7页 |
| 图表索引 | 第7-9页 |
| 英文缩略词 | 第9-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 前言 | 第15-16页 |
| 一、材料和方法 | 第16-32页 |
| (一) 实验材料 | 第16-22页 |
| 1.细胞 | 第16页 |
| 2.组织标本 | 第16页 |
| 3.动物 | 第16页 |
| 4.试剂 | 第16-19页 |
| ·抗体 | 第16-17页 |
| ·主试剂 | 第17-19页 |
| 5.主要仪器及用品 | 第19-20页 |
| 6.计算机分析软件 | 第20页 |
| 7.主要自配试剂及配方 | 第20-22页 |
| (二) 实验方法 | 第22-32页 |
| 1.细胞培养 | 第22页 |
| ·人肝癌组织来源细胞原代培养 | 第22页 |
| ·人肝癌细胞株及杂交瘤细胞的培养 | 第22页 |
| ·肝癌干细胞的无血清悬浮培养 | 第22页 |
| 2.细胞免疫荧光实验 | 第22-24页 |
| ·活细胞免疫荧光实验 | 第22-23页 |
| ·固定细胞免疫荧光实验 | 第23页 |
| ·球体细胞固定免疫荧光实验 | 第23-24页 |
| 3.流式细胞术检测标志物比例 | 第24页 |
| 4.免疫组织化学实验 | 第24-25页 |
| 5.细胞体外实验 | 第25-27页 |
| ·PKH26染色实验 | 第25页 |
| ·sphere细胞成球抑制实验 | 第25页 |
| ·细胞增殖实验 | 第25-26页 |
| ·Transwell侵袭实验 | 第26页 |
| ·Transwell迁移实验 | 第26-27页 |
| 6.动物实验 | 第27页 |
| ·SCID鼠致瘤实验 | 第27页 |
| ·抗体动物治疗实验 | 第27页 |
| 7.抗体纯化 | 第27-28页 |
| ·无血清杂交瘤上清的收集 | 第27页 |
| ·ELISA酶联免疫吸附法测定抗体产量 | 第27-28页 |
| ·疏水层析纯化IgM抗体 | 第28页 |
| ·ProteinG亲和纯化IgG抗体 | 第28页 |
| 8.抗原亲和纯化鉴定 | 第28-31页 |
| ·细胞蛋白提取 | 第28-29页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第28页 |
| ·细胞水溶性蛋白和膜溶性蛋白的提取 | 第28-29页 |
| ·蛋白定量 | 第29页 |
| ·抗体亲和柱的制备 | 第29页 |
| ·亲和纯化 | 第29-30页 |
| ·质谱鉴定 | 第30页 |
| ·免疫共沉淀纯化抗原 | 第30页 |
| ·免疫印迹Western blotting | 第30-31页 |
| 9.统计学分析 | 第31-32页 |
| 二、实验结果 | 第32-61页 |
| (一) 人肝癌干细胞的分离和鉴定 | 第32-39页 |
| 1.人肝癌组织中肝癌干细胞的分离鉴定 | 第32-35页 |
| ·人肝癌组织中癌细胞的分离及原代培养 | 第32页 |
| ·人肝癌组织原代细胞中肿瘤干细胞标志物检测 | 第32-34页 |
| ·人肝癌移植瘤中肿瘤干细胞标志物检测 | 第34-35页 |
| 2.人肝癌干细胞研究的细胞模型的筛选建立 | 第35-39页 |
| ·人肝癌细胞株MHCC97H的无血清悬浮培养 | 第35-36页 |
| ·人肝癌细胞株MHCC97H球体细胞具有顺铂耐药性 | 第36-37页 |
| ·人肝癌细胞株MHCC97H亲本细胞及球体细胞中肝癌干细胞标志物表达情况 | 第37-39页 |
| (二) 抗人肝癌干细胞功能性单抗的筛选鉴定 | 第39-41页 |
| 1.流式细胞术筛选靶向肝癌干细胞的单克隆抗体 | 第39页 |
| 2.体外功能实验筛选靶向肝癌干细胞功能性单抗 | 第39-41页 |
| (三) 抗人肝癌干细胞单抗11C9功能研究和靶抗原分离鉴定 | 第41-53页 |
| 1.抗人肝癌干细胞功能性单抗11C9在人肝癌细胞株中的表达情况 | 第41-42页 |
| ·单抗11C9在人肝癌细胞株MHCC97H中表达情况 | 第41-42页 |
| ·人肝癌细胞株MHCC97H中11C9识别抗原的亚细胞结果定位 | 第42页 |
| 2.单抗11C9阳性细胞的肿瘤干细胞相关分子表型的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.单抗11C9阳性细胞的肿瘤干细胞特性鉴定 | 第43-46页 |
| ·11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞耐药性比较 | 第43-44页 |
| ·11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞自我更新能力比较 | 第44-45页 |
| ·11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞侵袭能力比较 | 第45页 |
| ·11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞迁移能力比较 | 第45-46页 |
| 4.抗人肝癌干细胞单抗11C9阻断抗原功能基因的体外功能研究 | 第46页 |
| ·11C9单抗对人肝癌干细胞增殖的抑制作用 | 第46页 |
| ·11C9单抗对人肝癌细胞株MHCC97H细胞侵袭和迁移的抑制作用 | 第46页 |
| 5.抗人肝癌干细胞单抗11C9阻断抗原功能基因的体内功能研究 | 第46-47页 |
| 6.抗人肝癌干细胞单抗11C9识别靶抗原的分离鉴定 | 第47-53页 |
| ·功能性单抗11C9的纯化 | 第47-48页 |
| ·优化和筛选提取单抗识别抗原的方法与功能性抗原的分子量鉴定 | 第48-49页 |
| ·亲和层析纯化11C9识别抗原蛋白 | 第49页 |
| ·单抗11C9识别抗原蛋白的质谱鉴定 | 第49-50页 |
| ·单抗11C9识别抗原基因的鉴定 | 第50-53页 |
| ·免疫共沉淀验证11C9抗原基因 | 第50-51页 |
| ·细胞免疫荧光共定位验证11C9抗原基因 | 第51-53页 |
| (四) 抗人肝癌干细胞单抗4F11功能研究和靶抗原分离鉴定 | 第53-61页 |
| 1.抗人肝癌干细胞功能性单抗4F11在人肝癌细胞株中的表达情况 | 第53-54页 |
| ·单抗4F11在人肝癌细胞株MHCC97H中表达情况 | 第53页 |
| ·人肝癌细胞株MHCC97H中4F11识别抗原的亚细胞结果定位 | 第53-54页 |
| 2.单抗4F11阳性细胞的肿瘤干细胞相关分子表型的鉴定 | 第54-56页 |
| 3.抗人肝癌干细胞单抗4F11阻断抗原功能基因的体外功能研究 | 第56-57页 |
| ·单抗4F11对人肝癌干细胞增殖的抑制作用 | 第56页 |
| ·单抗4F11对人肝癌细胞株MHCC97H细胞侵袭的抑制作用 | 第56-57页 |
| ·单抗4F11对人肝癌细胞株MHCC97H细胞迁移的抑制作用 | 第57页 |
| 4.抗人肝癌干细胞单抗4F11识别靶抗原的分离鉴定 | 第57-61页 |
| ·功能性单抗4F11的纯化 | 第57-58页 |
| ·优化和筛选提取单抗识别抗原的方法与功能性抗原的分子量鉴定 | 第58-59页 |
| ·亲和层析纯化4F11识别抗原蛋白 | 第59页 |
| ·单抗4F11识别抗原蛋白的质谱鉴定 | 第59-61页 |
| 三、讨论 | 第61-68页 |
| 小结 | 第68-69页 |
| 论文综述 | 第69-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 附录 | 第80-81页 |
| 个人简历 | 第81-82页 |
| 基金资助情况 | 第82-83页 |
