| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 缩略语表 | 第8-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-38页 |
| 第一节 天然免疫与获得性免疫的关系 | 第17-23页 |
| ·天然免疫和获得性免疫的识别机制 | 第18-19页 |
| ·模式识别受体 | 第19-20页 |
| ·Toll及TLRs | 第20-21页 |
| ·天然免疫识别病原并启动获得性免疫 | 第21-23页 |
| 第二节 宿主细胞对病毒的防御机制 | 第23-24页 |
| ·病毒的识别和抗病毒物质的产生 | 第23页 |
| ·细胞凋亡 | 第23-24页 |
| 第三节 鱼类免疫系统 | 第24-33页 |
| ·细胞因子 | 第25-29页 |
| ·干扰素 | 第25-27页 |
| ·肿瘤坏死因子α | 第27-28页 |
| ·IL-1β | 第28-29页 |
| ·趋化因子 | 第29-31页 |
| ·补体系统 | 第31页 |
| ·TLRs | 第31-32页 |
| ·抗菌肽 | 第32-33页 |
| 第四节 本研究的目的和意义 | 第33-38页 |
| 第二章 紫外灭活GCHV诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建 | 第38-55页 |
| ·材料与方法 | 第39-49页 |
| ·细胞株与病毒株 | 第39页 |
| ·细胞培养 | 第39-40页 |
| ·病毒增殖、纯化与紫外线灭活 | 第40-41页 |
| ·病毒增殖 | 第40页 |
| ·病毒纯化 | 第40页 |
| ·病毒灭活 | 第40-41页 |
| ·牙鲆胚胎细胞(FEC)的诱导 | 第41页 |
| ·诱导后牙鲆胚胎细胞抗病毒物质检测 | 第41页 |
| ·差减cDNA文库的构建 | 第41-48页 |
| ·病毒诱导牙鲆胚胎细胞的制备 | 第41-42页 |
| ·病毒诱导和对照FEC总RNA的提取 | 第42-43页 |
| ·病毒诱导和未经诱导的FEC mRNA的分离 | 第43页 |
| ·差减cDNA文库的建立 | 第43-47页 |
| ·Tester cDNA接头连接效率检测和差减文库差减效率检测 | 第47-48页 |
| ·差减cDNA质粒文库的构建 | 第48-49页 |
| ·E coli. DH5α感受态的制备 | 第48-49页 |
| ·连接 | 第49页 |
| ·转化 | 第49页 |
| ·差减文库cDNA 片段大小检测 | 第49页 |
| ·结果 | 第49-53页 |
| ·紫外灭活GCHV诱导的FEC抗病毒活性检测 | 第49-50页 |
| ·Tester cDNA的接头连接效率的检测 | 第50-51页 |
| ·cDNA文库差减效率检测 | 第51页 |
| ·差减文库cDNA片段大小的鉴定 | 第51-53页 |
| ·讨论 | 第53-55页 |
| 第三章 差减cDNA文库的筛选及ESTs分析 | 第55-70页 |
| ·材料与方法 | 第56-59页 |
| ·试剂、酶及载体 | 第56页 |
| ·PCR筛选 | 第56页 |
| ·斑点杂交筛选 | 第56-58页 |
| ·差减cDNA文库探针和对照cDNA文库探针的制备 | 第56-57页 |
| ·斑点杂交 | 第57页 |
| ·阳性克隆筛选 | 第57-58页 |
| ·阳性克隆cDNA片段测序及序列分析 | 第58页 |
| ·SMART cDNA的合成 | 第58-59页 |
| ·PCR检测 | 第59页 |
| ·结果 | 第59-66页 |
| ·差减cDNA片段的PCR筛选 | 第59-60页 |
| ·差减cDNA片段的斑点杂交筛选 | 第60-61页 |
| ·差减cDNA片段的序列测定和分析 | 第61-65页 |
| ·部分差减cDNA片段的差异表达分析 | 第65-66页 |
| ·讨论 | 第66-70页 |
| 第四章 色素上皮衍生因子基因的克隆、分析和鉴定 | 第70-96页 |
| ·前言 | 第70-72页 |
| ·丝氨酸蛋白酶抑制剂 | 第70-71页 |
| ·色素上皮衍生因子 | 第71-72页 |
| ·材料与方法 | 第72-78页 |
| ·试剂、酶及载体 | 第72页 |
| ·RACE-PCR克隆PEDF基因全长cDNA | 第72-74页 |
| ·PCR产物回收 | 第74页 |
| ·感受态细胞的制备、连接、转化及阳性克隆筛选 | 第74页 |
| ·细胞及组织总RNA的提取 | 第74-75页 |
| ·细胞及组织总RNA的TRIzol一步法提取 | 第74-75页 |
| ·组织总RNA的SV Total法提取 | 第75页 |
| ·RT-PCR | 第75页 |
| ·Real-time PCR | 第75-76页 |
| ·牙鲆基因组DNA的提取 | 第76页 |
| ·PEDF基因组DNA的克隆 | 第76-77页 |
| ·PEDF基因的生物信息学分析 | 第77-78页 |
| ·结果 | 第78-93页 |
| ·紫外灭活GCHV诱导PEDF的上调表达 | 第78页 |
| ·PEDF全长cDNA的克隆 | 第78页 |
| ·PEDF cDNA序列分析 | 第78-81页 |
| ·PEDF的氨基酸序列的比较分析 | 第81-86页 |
| ·牙鲆PEDF基因组DNA结构 | 第86-88页 |
| ·PEDF基因的染色体定位及PEDF基因的进化分析 | 第88-93页 |
| ·讨论 | 第93-96页 |
| 第五章 PEDF蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第96-109页 |
| ·材料与方法 | 第96-104页 |
| ·材料 | 第96页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第96-99页 |
| ·引物设计 | 第96-97页 |
| ·表达片段的克隆 | 第97-98页 |
| ·酶切 | 第98页 |
| ·目的片段的回收 | 第98页 |
| ·连接、转化及筛选 | 第98-99页 |
| ·诱导表达筛选阳性克隆 | 第99-100页 |
| ·PEDF的大量表达 | 第100页 |
| ·pET32a-PEDF的包涵体制备 | 第100页 |
| ·pET32a-PEDF的树脂纯化 | 第100-101页 |
| ·pET156-PEDF蛋白的纯化 | 第101-102页 |
| ·包涵体的制备 | 第101-102页 |
| ·溶解包涵体和重折叠 | 第102页 |
| ·透析 | 第102页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第102页 |
| ·细胞和组织蛋白的提取 | 第102-103页 |
| ·TRIzol法细胞和组织蛋白的提取 | 第102-103页 |
| ·一步法细胞和组织蛋白的提取 | 第103页 |
| ·Western免疫印迹 | 第103-104页 |
| ·免疫吸附 | 第104页 |
| ·结果 | 第104-108页 |
| ·克隆片段的PCR扩增及克隆 | 第104-105页 |
| ·表达载体的构建 | 第105页 |
| ·原核表达与鉴定 | 第105-108页 |
| ·多克隆抗体的制备与鉴定 | 第108页 |
| ·讨论 | 第108-109页 |
| 第六章 牙鲆PEDF蛋白的亚细胞定位 | 第109-118页 |
| ·材料与方法 | 第109-112页 |
| ·材料 | 第109-110页 |
| ·牙鲆胚胎细胞总RNA的提取 | 第110页 |
| ·逆转录 | 第110页 |
| ·牙鲆PEDF 编码区cDNA的扩增 | 第110-111页 |
| ·牙鲆PEDF 编码区cDNA的克隆 | 第111页 |
| ·PEDF与EGFP融合蛋白表达载体的构建 | 第111页 |
| ·pEGFP-PEDF质粒转染牙鲆胚胎细胞 | 第111页 |
| ·细胞免疫组化 | 第111-112页 |
| ·结果 | 第112-116页 |
| ·牙鲆编码区cDNA的扩增 | 第112页 |
| ·pEGFP-PEDF融合基因真核表达载体的构建 | 第112-114页 |
| ·细胞转染和免疫组化结果 | 第114-116页 |
| ·讨论 | 第116-118页 |
| 第七章 PEDF的诱导表达特征分析 | 第118-134页 |
| ·材料与方法 | 第118-122页 |
| ·材料 | 第118-119页 |
| ·ARTA诱导 | 第119页 |
| ·低氧诱导 | 第119页 |
| ·CoC12诱导 | 第119页 |
| ·葡萄糖诱导 | 第119页 |
| ·细胞老化过程中PEDF的表达 | 第119-120页 |
| ·病毒及poly(I:C)诱导 | 第120页 |
| ·PEDF细胞保护实验 | 第120页 |
| ·牙鲆体内攻毒实验 | 第120页 |
| ·细胞及组织总RNA的提取 | 第120-121页 |
| ·Real-time PCR | 第121-122页 |
| ·结果 | 第122-131页 |
| ·ARTA诱导表达结果 | 第122页 |
| ·低氧状态下PEDF的表达时序 | 第122-124页 |
| ·PEDF表达量与细胞培养时间无关 | 第124页 |
| ·葡萄糖诱导诱导表达结果 | 第124页 |
| ·PEDF在病毒诱导的FEC细胞中上调表达 | 第124-128页 |
| ·PEDF的保护实验 | 第128页 |
| ·攻毒前后牙鲆组织PEDF的表达 | 第128-131页 |
| ·讨论 | 第131-134页 |
| 参考文献 | 第134-156页 |
| 总结 | 第156-157页 |
| 附录 | 第157-158页 |
| 致谢 | 第158页 |
