| 第一章 前言 | 第1-14页 |
| ·乳酸的结构与性质 | 第9-10页 |
| ·L-乳酸的用途及供求情况 | 第10-11页 |
| ·乳酸的生产方法 | 第11-12页 |
| ·发酵法 | 第11页 |
| ·化学合成法 | 第11-12页 |
| ·酶法生成乳酸 | 第12页 |
| ·乳酸生产方法的比较 | 第12页 |
| ·L-乳酸脱氢酶 | 第12-13页 |
| ·大肠杆菌发酵生产L-乳酸 | 第13页 |
| ·本论文的主要研究内容和意义 | 第13-14页 |
| 第二章 乳酸脱氢酶的克隆及在大肠杆菌中的表达 | 第14-31页 |
| ·材料 | 第14-15页 |
| ·菌株与质粒 | 第14页 |
| ·酶与试剂 | 第14-15页 |
| ·方法与步骤 | 第15-22页 |
| ·乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的复苏培养 | 第15页 |
| ·乳酸片球菌菌种的保存 | 第15页 |
| ·乳酸片球菌染色体DNA的制备 | 第15页 |
| ·L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)的引物设计和PCR扩增 | 第15-16页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第16页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第16-17页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第17页 |
| ·DNA的酶切 | 第17-19页 |
| ·连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞 | 第19页 |
| ·阳性重组子的筛选和酶切验证 | 第19-20页 |
| ·外源片段在大肠杆菌中的诱导表达 | 第20页 |
| ·表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第20-21页 |
| ·大肠杆菌细胞的破碎 | 第21页 |
| ·乳酸脱氢酶活力的测定 | 第21-22页 |
| ·结果和分析 | 第22-30页 |
| ·乳酸脱氢酶基因(ldhL)表达质粒pSE-ldhL的构建 | 第22-24页 |
| ·乳酸脱氢酶酶基因(ldhL基因)pET-22b(+)表达质粒的构建 | 第24-27页 |
| ·酶活力的测定 | 第27-28页 |
| ·酶学特性的研究 | 第28-30页 |
| ·讨论 | 第30-31页 |
| ·酶活力的分析 | 第30页 |
| ·诱导表达条件 | 第30页 |
| ·SD序列与ATG之间的距离 | 第30-31页 |
| 第三章 乙醇脱氢酶基因(ADHE)同源双交换盒的构建及大肠杆菌乙醇脱氢酶基因灭活株的构建 | 第31-49页 |
| ·引言 | 第31-37页 |
| ·代谢工程的概念与方法 | 第32-33页 |
| ·基因敲除 | 第33-34页 |
| ·本研究思路 | 第34-35页 |
| ·技术路线 | 第35-37页 |
| ·材料 | 第37页 |
| ·方法与步骤 | 第37-42页 |
| ·E.coliK12株基因组总DNA的制备 | 第37页 |
| ·乙醇脱氢酶基因(adhE)的引物设计和PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·adhE基因的连接与转化 | 第38页 |
| ·DNA连接产物的转化 | 第38页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第38页 |
| ·pGEM-adhE重组质粒PCR验证 | 第38-39页 |
| ·Tcr基因的引物设计和PCR扩增 | 第39-40页 |
| ·Tc~r基因的PCR产物的酶切、连接与转化 | 第40页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第40-41页 |
| ·pGEM-adhE-tet重组子的质粒PCR验证 | 第41页 |
| ·基因敲除交换盒的获得 | 第41页 |
| ·大肠杆菌BL21株电脉冲感受态细胞的制备 | 第41页 |
| ·基因敲除交换盒电脉冲导入 | 第41-42页 |
| ·结果 | 第42-47页 |
| ·adhE基因的克隆 | 第42页 |
| ·pGEM-adhE重组质粒的构建 | 第42页 |
| ·pGEM-adhE重组质粒的验证 | 第42-43页 |
| ·四环素抗性基因的扩增 | 第43-44页 |
| ·四环素抗性基因的插入连接 | 第44-46页 |
| ·基因敲除交换盒的获得 | 第46-47页 |
| ·讨论 | 第47-49页 |
| ·重组系统 | 第47-48页 |
| ·减少假阳性 | 第48页 |
| ·电击转化效率 | 第48页 |
| ·假抗性克隆 | 第48-49页 |
| 第四章 结论 | 第49-50页 |
| ·结论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-54页 |
| 附录Ⅰ | 第54-58页 |
| 主要仪器设备 | 第54页 |
| 常用缓冲液配方 | 第54-57页 |
| 常用培养基配方 | 第57-58页 |
| 附录Ⅱ | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第60页 |
