| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-10页 |
| 1 前言 | 第10-33页 |
| ·问题的提出 | 第10页 |
| ·血型转换研究现状 | 第10-13页 |
| ·血型转换的基本思路 | 第11-12页 |
| ·聚乙二醇包裹红细胞制备通用血 | 第12页 |
| ·血型转换的工具酶 | 第12-13页 |
| ·α-半乳糖苷酶的研究现状 | 第13-19页 |
| ·α-半乳糖苷酶的生理意义 | 第14页 |
| ·α-半乳糖苷酶的定位 | 第14页 |
| ·α-半乳糖苷酶的酶学特性 | 第14-16页 |
| ·α-半乳糖苷酶的其它功能及应用 | 第16-17页 |
| ·α-半乳糖苷酶在血型转换上的研究 | 第17-19页 |
| ·基因工程手段在α-半乳糖苷酶研究中的应用 | 第19-22页 |
| ·α-半乳糖苷酶基因的克隆与重组表达 | 第19-20页 |
| ·重组α-半乳糖苷酶在血型转换上的应用 | 第20-22页 |
| ·咖啡概述 | 第22-23页 |
| ·甲醇巴斯德毕赤氏酵母P.pastoris表达系统 | 第23-30页 |
| ·酵母基因表达系统概况 | 第23-27页 |
| ·甲醇巴斯德毕赤氏酵母P.pastoris表达系统 | 第27-30页 |
| ·论文设计思想及研究目标 | 第30-33页 |
| ·选题依据 | 第30-31页 |
| ·论文设计 | 第31-32页 |
| ·研究目标 | 第32-33页 |
| 2 材料与方法 | 第33-52页 |
| ·α-半乳糖苷酶基因克隆与测序 | 第33-39页 |
| ·材料 | 第33页 |
| ·菌种及载体 | 第33页 |
| ·试剂 | 第33页 |
| ·方法 | 第33-39页 |
| ·咖啡豆总RNA的提取 | 第33-34页 |
| ·PCR引物的设计与合成 | 第34页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第34-35页 |
| ·α-Gal的PCR扩增 | 第35页 |
| ·PCR目的片段的纯化与回收 | 第35-36页 |
| ·PCR回收产物的克隆 | 第36-39页 |
| ·克隆片段的DNA测序 | 第39页 |
| ·微生物工程菌的构建 | 第39-46页 |
| ·毕赤酵母pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gnl-Z,pGAPZαA/Gal-D重组载体的构建 | 第39-40页 |
| ·pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gal-Z,pGAPZαA/Gal-D重组载体的筛选、鉴定 | 第40-41页 |
| ·pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gal-Z,pGAPZαA/Gal-D重组载体转化毕赤氏酵母及工程菌的鉴定 | 第41-43页 |
| ·大肠杆菌pET-22b/Gal-D重组载体的构建 | 第43-44页 |
| ·pET-22/Gal-D重组载体的筛选、鉴定 | 第44-45页 |
| ·pET-22/Gal-D重组载体转化大肠杆菌及工程菌的鉴定 | 第45-46页 |
| ·工程菌的发酵表达 | 第46-49页 |
| ·摇瓶发酵 | 第46-47页 |
| ·pPICzαA/Gal-Z和pPICZαA/Gal-D重组酵母的摇瓶发酵 | 第46页 |
| ·pGAPZαA/Gal-D重组酵母的摇瓶发酵 | 第46-47页 |
| ·pET-22b/Gal-D诱导型分泌重组大肠杆菌的摇瓶发酵 | 第47页 |
| ·发酵罐发酵 | 第47-49页 |
| ·pPICZαA/Gal-D重组酵母的发酵罐发酵 | 第48-49页 |
| ·SDS-PAGE与酶活检测 | 第49-52页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测 | 第49-50页 |
| ·发酵上清液处理 | 第49-50页 |
| ·发酵产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第50页 |
| ·酶活检测 | 第50-52页 |
| ·样品的处理 | 第50-51页 |
| ·标准对-硝基苯酚浓度的测定 | 第51页 |
| ·酶活检测 | 第51-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-72页 |
| ·α-半乳糖苷酶1cDNA基因克隆与测序 | 第52-58页 |
| ·咖啡豆总RNA的提取 | 第52-53页 |
| ·α-Gal cDNA中目的片段的PCR扩增 | 第53页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第53-54页 |
| ·克隆片段的核苷酸序列分析 | 第54-58页 |
| ·微生物工程菌的构建结果 | 第58-61页 |
| ·毕亦酵母重组载体的构建结果 | 第58-59页 |
| ·pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gal-D重组载体转化毕赤氏酵母及工程菌的PCR鉴定结果 | 第59-60页 |
| ·大肠杆菌重组载体的构建结果 | 第60-61页 |
| ·pET-22/Gal-D/BL21工程菌的PCR鉴定结果 | 第61页 |
| ·工程菌的发酵表达与检测 | 第61-72页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测 | 第61-65页 |
| ·酵母生长曲线图 | 第65-66页 |
| ·酵母工程菌发酵液蛋白质含量与酶活的检测 | 第66-71页 |
| ·pET-22/Gal-D/BL21工程菌的摇瓶发酵酶活测定 | 第71-72页 |
| 4 结论 | 第72-74页 |
| 5 讨论 | 第74-79页 |
| ·关于咖啡豆总RNA提取方法和取材 | 第74页 |
| ·PCR引物中引入酶切位点 | 第74-75页 |
| ·影响毕赤酵母高效表达外源蛋白因素 | 第75-78页 |
| ·转化及对重组转化子的筛选 | 第75页 |
| ·载体与遗传背景的影响 | 第75-76页 |
| ·外源基因自身的影响 | 第76页 |
| ·蛋白质分泌的影响因素 | 第76-77页 |
| ·发酵罐发酵条件的影响 | 第77-78页 |
| ·进一步研究的设想要点 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-88页 |
| 附件 | 第88-94页 |
| 缩写词 | 第94-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
