| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-16页 |
| ·ONCONASE 的研究概述 | 第12-14页 |
| ·Onconase 的结构和稳定性 | 第12-13页 |
| ·Onconase 的抗肿瘤作用机制 | 第13页 |
| ·Onconase 免疫调节和抗病毒作用 | 第13页 |
| ·Onconase 存在的问题 | 第13-14页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统概况 | 第14-16页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中常用的分泌信号 | 第14-15页 |
| ·不同分泌信号引导的Onconase 在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第15-16页 |
| 第二章 实验材料 | 第16-22页 |
| ·材料 | 第16-19页 |
| ·菌株 | 第16页 |
| ·质粒 | 第16页 |
| ·细胞及实验动物 | 第16页 |
| ·限制性内切酶及工具酶 | 第16页 |
| ·试剂盒 | 第16页 |
| ·核酸及蛋白分子量标准 | 第16页 |
| ·引物 | 第16-18页 |
| ·主要仪器和层析柱 | 第18-19页 |
| ·试剂 | 第19-22页 |
| ·主要试剂 | 第19页 |
| ·主要培养基 | 第19-20页 |
| ·主要溶液 | 第20-22页 |
| 第三章 实验步骤 | 第22-38页 |
| ·目的基因的克隆 | 第22-27页 |
| ·gONC 和agONC 基因的克隆 | 第22-24页 |
| ·gONC 基因的克隆 | 第22页 |
| ·agONC 基因的克隆 | 第22-24页 |
| ·EAEA-gONC 和EAEA-agONC 融合基因的克隆 | 第24-25页 |
| ·EAEA-gONC 融合基因的克隆 | 第24-25页 |
| ·EAEA-agONC 融合基因的克隆 | 第25页 |
| ·pre-gONC 和pre-agONC 融合基因的克隆 | 第25-27页 |
| ·pre-gONC 融合基因的克隆 | 第25-26页 |
| ·pre-agONC 融合基因的克隆 | 第26-27页 |
| ·含不同分泌信号的表达载体的构建 | 第27-34页 |
| ·表达载体pPIC9-gONC 和pPIC9-agONC 的构建 | 第28-30页 |
| ·表达载体pPIC9-gONC 的构建 | 第28-29页 |
| ·表达载体pPIC9-agONC 的构建 | 第29-30页 |
| ·表达载体pPIC9-EAEA-gONC 和pPIC9-EAEA-agONC 的构建 | 第30-32页 |
| ·表达载体pPIC9-EAEA-gONC 的构建 | 第30-31页 |
| ·表达载体pPIC9-EAEA-agONC 的构建 | 第31-32页 |
| ·表达载体pPIC9-pre-gONC 和pPIC9-pre-agONC 的构建 | 第32-34页 |
| ·表达载体pPIC9-pre-gONC 的构建 | 第32-33页 |
| ·表达载体pPIC9-pre-agONC 的构建 | 第33-34页 |
| ·表达载体转化酵母表达菌株及目的基因的诱导表达 | 第34-36页 |
| ·各表达载体的线性化 | 第34-35页 |
| ·巴斯德毕赤酵母GS115 感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·电转化 | 第35-36页 |
| ·不同巴斯德毕赤酵母重组菌在摇瓶里的诱导表达 | 第36页 |
| ·高效表达工程菌株的发酵罐培养及纯化 | 第36页 |
| ·表达产物的鉴定和体外活性检测 | 第36-38页 |
| ·表达产物的质谱检测和N 末端氨基酸残基分析 | 第36页 |
| ·双倒数法测定表达产物的酶学参数 | 第36-37页 |
| ·MTT 法检测表达产物的体外活性 | 第37-38页 |
| 第四章 实验结果 | 第38-52页 |
| ·目的基因的克隆 | 第38-40页 |
| ·gONC 和agONC 基因的克隆 | 第38页 |
| ·EAEA-gONC 和EAEA-agONC 基因的克隆 | 第38-39页 |
| ·pre-gONC 和pre-agONC 基因的克隆 | 第39-40页 |
| ·含不同分泌信号表达载体的构建 | 第40-45页 |
| ·pPIC9-gONC 和pPIC9-agONC 表达载体的构建与序列分析 | 第40-41页 |
| ·pPIC9-EAEA-gONC和pPIC9-EAEA-agONC表达载体的构建与序列分析 | 第41-43页 |
| ·pPIC9-pre-gONC 和pPIC9-pre-agONC 表达载体的构建与序列分析 | 第43-45页 |
| ·不同分泌信号的表达载体转化表达菌株及高表达工程菌的筛选 | 第45-46页 |
| ·工程菌5L 生物反应器培养 | 第46-47页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第47-49页 |
| ·目的蛋白的纯化的纯化过程 | 第47-48页 |
| ·目的蛋白的质谱分析和N 端氨基酸测序 | 第48-49页 |
| ·目的蛋白活性的体外评价 | 第49-52页 |
| ·目的蛋白酶学性质的检测分析 | 第49-50页 |
| ·MTT 法检测目的蛋白对肿瘤细胞的抑制作用 | 第50-52页 |
| 第五章 讨论 | 第52-54页 |
| 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 发表文章 | 第59-87页 |
| 个人简历 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
