| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-29页 |
| ·琼胶酶 | 第11-15页 |
| ·琼胶酶的来源 | 第11-12页 |
| ·琼胶酶的分类 | 第12-13页 |
| ·琼胶酶的酶学性质研究 | 第13-14页 |
| ·琼胶酶的分子生物学研究 | 第14页 |
| ·琼胶酶的分泌 | 第14页 |
| ·琼胶酶的应用 | 第14-15页 |
| ·丝氨酸蛋白酶 | 第15-20页 |
| ·蛋白酶的分类 | 第15-16页 |
| ·丝氨酸蛋白酶的结构 | 第16-17页 |
| ·丝氨酸蛋白酶的酶学性质 | 第17-18页 |
| ·丝氨酸蛋白酶DegP 的功能 | 第18-20页 |
| ·哈维氏弧菌引起的水产病害 | 第20-25页 |
| ·哈维氏弧菌的致病因子 | 第22-23页 |
| ·哈维氏弧菌病原的防治 | 第23-25页 |
| ·哈维氏弧菌病原的防治措施 | 第23-24页 |
| ·哈维氏弧菌疫苗的研究 | 第24-25页 |
| ·疫苗传递系统的研究进展 | 第25-28页 |
| ·细菌传递系统 | 第25-27页 |
| ·利用细菌传递疫苗 | 第27-28页 |
| ·本论文的研究意义及目的 | 第28-29页 |
| 第二章 琼胶酶 AgaV 基因的克隆及其表达纯化 | 第29-45页 |
| ·材料和方法 | 第29-40页 |
| ·琼胶降解菌株的筛选和鉴定 | 第30-31页 |
| ·琼胶降解菌株的筛选 | 第30页 |
| ·菌株16S rDNA 鉴定 | 第30-31页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的克隆 | 第31-35页 |
| ·V134 基因组DNA 的提取和酶切 | 第31-33页 |
| ·DNA 片段和pBR322 载体的连接 | 第33页 |
| ·转化 | 第33-34页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的序列鉴定 | 第34-35页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因在大肠杆菌中的表达 | 第35-39页 |
| ·琼胶酶AgaV 的基因扩增 | 第35-36页 |
| ·pETUA 表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的诱导表达 | 第37-38页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因表达条件的优化 | 第38-39页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的大量诱导 | 第39页 |
| ·重组琼胶酶AgaV 的纯化 | 第39-40页 |
| ·重组琼胶酶AgaV 的纯化 | 第39-40页 |
| ·重组琼胶酶AgaV 纯化过程的优化 | 第40页 |
| ·结果和讨论 | 第40-45页 |
| ·具有降解琼胶能力的弧菌V134 的筛选和鉴定 | 第40-41页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的克隆和序列分析 | 第41-42页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的上游序列分析 | 第42-43页 |
| ·琼胶酶AgaV 基因的结构分析 | 第43页 |
| ·琼胶酶AgaV 的表达和纯化 | 第43-45页 |
| 第三章 琼胶酶 AgaV 的理化性质测定 | 第45-52页 |
| ·材料和方法 | 第45-48页 |
| ·酶活力的测定 | 第45-46页 |
| ·采用3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS）进行标准曲线的测定 | 第45-46页 |
| ·琼胶酶AgaV 酶活力的测定 | 第46页 |
| ·琼胶酶AgaV 最适温度的测定 | 第46页 |
| ·琼胶酶AgaV 最适pH 的测定 | 第46-47页 |
| ·各种离子对琼胶酶AgaV 酶活性的影响 | 第47页 |
| ·TLC 分析琼胶酶AgaV 降解琼脂糖的最终产物 | 第47-48页 |
| ·结果和讨论 | 第48-52页 |
| ·琼胶酶AgaV 酶活力的测定 | 第48-49页 |
| ·琼胶酶AgaV 的最适温度 | 第49页 |
| ·琼胶酶AgaV 的最适pH | 第49-50页 |
| ·不同离子对琼胶酶AgaV 酶活性的影响 | 第50页 |
| ·琼胶酶AgaV 降解琼胶糖的最终产物的分析 | 第50-52页 |
| 第四章 琼胶酶 AgaV 的应用-(1)从琼脂糖凝胶中回收 DNA | 第52-54页 |
| ·材料和方法 | 第52-53页 |
| ·Ap 基因的PCR 扩增 | 第52页 |
| ·利用AgaV 从琼脂糖凝胶中回收DNA | 第52-53页 |
| ·结果和讨论 | 第53-54页 |
| ·利用纯化的琼胶酶AgaV 从琼脂糖凝胶中回收DNA | 第53-54页 |
| 第五章 琼胶酶 AgaV 的应用-(2)构建捕获分泌序列的载体pBU | 第54-59页 |
| ·材料和方法 | 第54-56页 |
| ·pBU 载体构建原理 | 第55页 |
| ·pBU 载体的构建 | 第55-56页 |
| ·利用pBU 载体从哈维氏弧菌T4 和链球菌G26 中进行分泌序列的筛选 | 第56页 |
| ·结果和讨论 | 第56-59页 |
| ·捕获分泌序列的载体pBU | 第56-57页 |
| ·利用pBU 载体从哈维氏弧菌T4 和链球菌G26 中筛选分泌序列 | 第57-59页 |
| 第六章 丝氨酸蛋白酶 DegQ_(Vh)基因的克隆及其表达纯化 | 第59-66页 |
| ·材料和方法 | 第59-63页 |
| ·丝氨酸蛋白酶degQ_(Vh) 基因的克隆 | 第60-61页 |
| ·degQ_(Vh)基因在大肠杆菌中的表达 | 第61页 |
| ·pETD 表达载体的构建 | 第61页 |
| ·丝氨酸蛋白酶DegQ_(Vh) 基因在大肠杆菌的表达 | 第61页 |
| ·丝氨酸蛋白酶DegQ_(Vh) 的纯化 | 第61-62页 |
| ·BUS 系列的其它基因的克隆和蛋白表达 | 第62-63页 |
| ·其它4 个BUS 基因的克隆和大肠杆菌中表达载体的构建 | 第62页 |
| ·BUS 系列蛋白大肠杆菌中的表达和纯化 | 第62-63页 |
| ·结果和讨论 | 第63-66页 |
| ·丝氨酸蛋白酶DegQ_(Vh) 全基因序列比对和结构域的分析 | 第63-64页 |
| ·DegQ_(Vh)在大肠杆菌中的表达和纯化 | 第64页 |
| ·BUS1、BUS2、BUS3 和BUS5 的蛋白表达和纯化 | 第64-66页 |
| 第七章 DegQ_(Vh)的抗原保护效应检测及其免疫应用 | 第66-76页 |
| ·材料和方法 | 第66-73页 |
| ·重组蛋白酶DegQ_(Vh)的保护效应检测 | 第67页 |
| ·重组蛋白DegQ_(Vh) 于牙鲆体内产生特异性抗体的效价检测 | 第67-70页 |
| ·大鼠抗牙鲆IgM 多克隆抗体的制备 | 第67-70页 |
| ·重组蛋白DegQ_(Vh)在牙鲆体内诱导产生的抗体水平 | 第70页 |
| ·抗原蛋白DegQ_(Vh) 的细菌传递系统的构建 | 第70-73页 |
| ·载体pBRB、pBT、pBTA1 和pBTA2 的构建 | 第70-71页 |
| ·pBQ、pBQ1 和pBQ2 表达质粒的构建 | 第71页 |
| ·DH5α/pBQ、DH5α/pBQ1 和DH5α/pBQ2 菌株中抗原蛋白DegQ_(Vh) 的细胞定位 | 第71-72页 |
| ·DH5α/pBQ 和DH5α/pBQ1 表达菌株的抗原保护效应检测 | 第72页 |
| ·DH5α/pBTA1、DH5α/pBQ 和DH5α/pBQ1 菌株在牙鲆体内的存活分析 | 第72-73页 |
| ·结果和讨论 | 第73-76页 |
| ·DegQ_(Vh)的免疫保护性 | 第73页 |
| ·DegQ_(Vh)在鱼体内诱导产生的抗体效应 | 第73页 |
| ·表达菌株DH5α/pBQ、DH5α/pBQ1 和DH5α/pBQ2 中DegQ_(Vh)的细胞定位 | 第73-74页 |
| ·活体疫苗的免疫保护原性 | 第74-75页 |
| ·DegQ_(Vh)携带菌株在牙鲆体内的存活分析 | 第75-76页 |
| 第八章 DegQ_(Vh)的酶活性质研究 | 第76-86页 |
| ·材料和方法 | 第76-81页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 降解酪蛋白的研究 | 第76-77页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 的最适作用温度和温度的稳定性 | 第77-78页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 的最适作用温度 | 第77页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 的温度稳定性 | 第77-78页 |
| ·蛋白DegQ_(Vh) 的最适pH | 第78页 |
| ·离子对蛋白酶DegQ_(Vh) 酶活性的影响 | 第78-79页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 的催化位点和催化所需的结构域 | 第79-81页 |
| ·三个定点和两个缺失突变基因的扩增和表达载体的构建 | 第79-80页 |
| ·突变体蛋白DegQ_(Vh) 的诱导表达和纯化 | 第80-81页 |
| ·突变体蛋白DegQ_(Vh) 的酶活性的测定 | 第81页 |
| ·结果和讨论 | 第81-86页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 降解酪蛋白 | 第81-82页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 的最适温度和热稳定性 | 第82-83页 |
| ·蛋白酶DegQ_(Vh) 的最适pH | 第83页 |
| ·不同离子和EDTA 对DegQ_(Vh) 活性的影响 | 第83-84页 |
| ·突变DegQ_(Vh) 的酶活性 | 第84-86页 |
| ·突变体蛋白DegQ_(Vh) 的检测 | 第84-85页 |
| ·突变体DegQ_(Vh) 酶活性的检测 | 第85-86页 |
| 第九章 degQ_(Vh)基因在哈维氏弧菌T4 中的表达和功能研究 | 第86-95页 |
| ·材料和方法 | 第86-91页 |
| ·degQ_(Vh)基因的启动子区域分析 | 第86-87页 |
| ·不同温度下degQ_(Vh)基因mRNA 表达水平的分析 | 第87-90页 |
| ·不同条件下T4 中mRNA 的提取和DNA 的消化 | 第87-88页 |
| ·Northern blotting 确定Real-Time PCR 的内参 | 第88-89页 |
| ·RNA 的转录 | 第89页 |
| ·Real-Time PCR 检验不同温度和时间degQ_(Vh) 基因的表达 | 第89-90页 |
| ·degQ_(Vh)基因的功能分析 | 第90-91页 |
| ·大肠杆菌degP 基因和T4 degQ_(Vh) 基因的氨基酸序列比对 | 第90页 |
| ·大肠杆菌degP 基因敲除 | 第90-91页 |
| ·degQ_(Vh)基因对EMZ1 菌株的功能互补 | 第91页 |
| ·结果和讨论 | 第91-95页 |
| ·degQ_(Vh)启动子区域分析 | 第91-92页 |
| ·Real-Time PCR 检验不同温度下degQ_(Vh) 的表达水平 | 第92-93页 |
| ·RNA 的提取 | 第92-93页 |
| ·Real-Time PCR 检测degQ_(Vh) 表达水平的变化 | 第93页 |
| ·degQ_(Vh)互补N7K 菌株中degP 的基因功能 | 第93-95页 |
| ·DegQ_(Vh) 和DegP 的序列同源性分析 | 第93页 |
| ·DegQ_(Vh) 对EMZ1 菌株的功能互补 | 第93-95页 |
| 结论 | 第95-96页 |
| 附录一缓冲液的配置 | 第96-103页 |
| 参考文献 | 第103-120页 |
| 博士期间发表的文章和申请的专利 | 第120-122页 |
| 致谢 | 第122页 |
