| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-11页 |
| 第1章 口蹄疫概述及研究进展 | 第11-28页 |
| ·口蹄疫概述 | 第11-12页 |
| ·FMDV 分子生物学研究概况及非结构蛋白基因研究进展 | 第12-16页 |
| ·FMDV 分子生物学研究概况 | 第12-13页 |
| ·FMDV 非结构蛋白基因研究进展 | 第13-16页 |
| ·近年 FMD 流行情况 | 第16-21页 |
| ·国际 | 第16-17页 |
| ·国内 | 第17-19页 |
| ·防控的艰巨性、复杂性和长期性 | 第19-20页 |
| ·对策和建议 | 第20-21页 |
| ·FMDV 鉴定的实验室技术 | 第21-24页 |
| ·病毒分离 | 第21-22页 |
| ·免疫血清学诊断 | 第22-23页 |
| ·分子生物学诊断技术 | 第23-24页 |
| ·FMD 疫苗研究进展 | 第24-27页 |
| ·传统疫苗 | 第25页 |
| ·新型疫苗 | 第25-27页 |
| ·展望 | 第27-28页 |
| 第2章 FMDV 非结构蛋白基因3ABC 的克隆、序列分析及表达研究 | 第28-53页 |
| ·材料 | 第28-29页 |
| ·毒株、菌种和载体 | 第28页 |
| ·生物试剂 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28-29页 |
| ·方法 | 第29-39页 |
| ·病毒的获得 | 第29页 |
| ·病毒基因组RNA 的提取 | 第29页 |
| ·引物的设计与合成 | 第29-30页 |
| ·C-DNA 第一链的合成 | 第30页 |
| ·PCR 反应 | 第30-32页 |
| ·PCR 产物的回收纯化 | 第32页 |
| ·3ABC 基因的T 载体克隆 | 第32-33页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·连接产物的转化 | 第33-34页 |
| ·3ABC 阳性克隆菌的筛选 | 第34-35页 |
| ·3ABC 重组质粒的提取 | 第35页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·3ABC 重组质粒DNA 测序 | 第36页 |
| ·3ABC 基因的序列分析 | 第36页 |
| ·3ABC 重组表达载体的构建 | 第36-39页 |
| ·结果 | 第39-47页 |
| ·3ABC 基因的PCR 扩增结果 | 第39-40页 |
| ·核苷酸序列和氨基酸序列的比较 | 第40-44页 |
| ·3ABC 原核表达载体的构建 | 第44-46页 |
| ·pET-32a-3ABC 的诱导表达及鉴定 | 第46-47页 |
| ·讨论 | 第47-53页 |
| ·以亚洲Ⅰ型FMDV 为模板克隆非结构蛋白基因3ABC 并与其它型毒株进行氨基酸序列比对分析 | 第47-48页 |
| ·引物设计及其酶切位点变异分析 | 第48页 |
| ·3ABC 目的蛋白表达条件的优化 | 第48-49页 |
| ·3ABC 氨基酸组成及影响表达的其他因素分析 | 第49-51页 |
| ·3ABC 基因功能与表达量少之间关联分析 | 第51页 |
| ·pET-28a、pET-32a 和pET-41a 三种表达载体分析 | 第51-52页 |
| ·实验方法的改进设想 | 第52-53页 |
| 第3章 FMDV 非结构蛋白基因3AB、3A 的克隆表达及抗原性分析. | 第53-72页 |
| ·材料 | 第53页 |
| ·质粒、载体和菌种 | 第53页 |
| ·主要试剂 | 第53页 |
| ·方法 | 第53-60页 |
| ·引物的设计与合成 | 第53页 |
| ·PCR 反应 | 第53-55页 |
| ·3AB、3A 基因的克隆与鉴定 | 第55页 |
| ·pET-28a、pET-41a 质粒的双酶切 | 第55-56页 |
| ·3AB、3A 目的基因片段的双酶切 | 第56页 |
| ·酶切产物的回收纯化 | 第56页 |
| ·3AB、3A 与pET-28a、pET-41a 的链接 | 第56-57页 |
| ·重组表达载体的转化 | 第57页 |
| ·阳性克隆菌的鉴定 | 第57-58页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第58页 |
| ·重组质粒的诱导表达 | 第58页 |
| ·Western blotting 分析 | 第58-59页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第59页 |
| ·pET-28-3A 的纯化 | 第59-60页 |
| ·结果 | 第60-67页 |
| ·3AB、3A 基因的PCR 扩增结果 | 第60-61页 |
| ·重组表达质粒的PCR 鉴定 | 第61-62页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第62-63页 |
| ·3AB 与3A 测序结果 | 第63-64页 |
| ·蛋白的表达 | 第64-65页 |
| ·蛋白的可溶性分析 | 第65-66页 |
| ·3A 蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| ·Western-Blot 分析 | 第67页 |
| ·讨论 | 第67-72页 |
| ·FMDV 非结构蛋白3A、3AB 的克隆及序列分析 | 第67-68页 |
| ·表达载体的选择 | 第68-69页 |
| ·3A、3AB 蛋白的表达及可溶性分析 | 第69-70页 |
| ·3A 蛋白的纯化分析 | 第70-72页 |
| 第4章 3A 蛋白间接 ELISA 方法的初步建立 | 第72-83页 |
| ·材料 | 第72页 |
| ·ELISA 抗原 | 第72页 |
| ·血清 | 第72页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第72页 |
| ·方法 | 第72-74页 |
| ·间接ELISA 操作方法 | 第72-73页 |
| ·抗原最佳包被浓度和待检血清稀释度的确定 | 第73页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第73页 |
| ·封闭液和封闭时间的选择 | 第73页 |
| ·底物反应时间的确定 | 第73页 |
| ·阴性、阳性临界值的确定 | 第73页 |
| ·特异性实验 | 第73-74页 |
| ·重复性试验 | 第74页 |
| ·符合性实验 | 第74页 |
| ·3A 蛋白抗原被牛大肠杆菌抗血清吸附前后对比试验 | 第74页 |
| ·结果 | 第74-79页 |
| ·最佳包被浓度和血清稀释浓度的确定 | 第74-75页 |
| ·酶标二抗工作浓度的确定 | 第75页 |
| ·封闭液和封闭时间的选择 | 第75-76页 |
| ·底物反应时间的确定 | 第76页 |
| ·阴性、阳性临界值的确定 | 第76-77页 |
| ·特异性实验 | 第77页 |
| ·重复性试验 | 第77-78页 |
| ·符合性试验 | 第78页 |
| ·3A 蛋白抗原经牛大肠杆菌抗血清吸附前后对比试验 | 第78-79页 |
| ·讨论 | 第79-83页 |
| ·3A ELISA 方法的建立分析 | 第79-81页 |
| ·3A-I-ELISA 和试剂盒3ABC-I-ELISA 实验对比结果分析 | 第81-83页 |
| 第5章 研究结论 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 附录 | 第92-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 作者简介 | 第97页 |
