| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-34页 |
| 1.1 引言 | 第14页 |
| 1.2 γ-氨基丁酸 | 第14-22页 |
| 1.2.1 γ-氨基丁酸(GABA)的结构与性质 | 第14-15页 |
| 1.2.2 γ-氨基丁酸的生理功能 | 第15-17页 |
| 1.2.3 γ-氨基丁酸的应用 | 第17-19页 |
| 1.2.4 GABA的制备 | 第19-22页 |
| 1.3 谷氨酸脱羧酶 | 第22-26页 |
| 1.3.1 谷氨酸脱羧酶的性质 | 第22-26页 |
| 1.3.1.1 哺乳动物的GAD | 第23-24页 |
| 1.3.1.2 植物的GAD | 第24-25页 |
| 1.3.1.3 微生物的GAD | 第25-26页 |
| 1.4 酶分子的改造 | 第26-31页 |
| 1.4.1 定向进化概念 | 第27-28页 |
| 1.4.2 突变文库的构建方法 | 第28-30页 |
| 1.4.3 突变体文库的筛选 | 第30-31页 |
| 1.4.4 定向进化技术的展望 | 第31页 |
| 1.4.5 酶分子的半理性设计 | 第31页 |
| 1.5 课题的研究目的和内容 | 第31-34页 |
| 1.5.1 研究目标和内容 | 第31-32页 |
| 1.5.2 研究方法、技术路线和实验方案 | 第32-34页 |
| 第二章 谷氨酸脱羧酶的随机突变 | 第34-54页 |
| 2.1 前言 | 第34页 |
| 2.2 材料与实验设备 | 第34-36页 |
| 2.2.1 材料 | 第34-36页 |
| 2.2.2 主要实验仪器 | 第36页 |
| 2.3 试验方法 | 第36-44页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒的提取 | 第36-37页 |
| 2.3.2 大肠杆菌CaCl_2感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 2.3.3 易错PCR方法构建GAD1407突变体文库 | 第37-38页 |
| 2.3.4 位点Q51的饱和突变 | 第38-39页 |
| 2.3.5 GAD1407突变体的诱导表达 | 第39页 |
| 2.3.6 GAD 1407突变文库的初筛 | 第39-40页 |
| 2.3.7 GAD 1407阳性克隆的复筛 | 第40页 |
| 2.3.8 突变酶和野生型GAD的表达和纯化 | 第40页 |
| 2.3.9 粗酶液的蛋白电泳 | 第40-41页 |
| 2.3.10 考马斯亮蓝法测定GAD的含量 | 第41-43页 |
| 2.3.11 突变酶酶学参数的测定 | 第43-44页 |
| 2.3.12 光谱分析 | 第44页 |
| 2.4 结果 | 第44-51页 |
| 2.4.1 突变文库的构建 | 第44-46页 |
| 2.4.2 突变子的筛选与鉴定 | 第46-48页 |
| 2.4.3 位点Q51的定点饱和突变 | 第48-49页 |
| 2.4.4 Q51H比活力及酶学参数的确定 | 第49-50页 |
| 2.4.5 突变酶Q51H圆二色谱分析 | 第50-51页 |
| 2.5 位点分析 | 第51-52页 |
| 2.6 小结 | 第52-54页 |
| 第三章 GAD1407的半理性设计 | 第54-70页 |
| 3.1 引言 | 第54页 |
| 3.2 材料及试剂 | 第54-55页 |
| 3.2.1 宿主菌及质粒 | 第54页 |
| 3.2.2 工具酶及分子生物学试剂 | 第54页 |
| 3.2.3 化学试剂 | 第54-55页 |
| 3.3 实验方法 | 第55-60页 |
| 3.3.1 GAD1407的同源建模 | 第55-56页 |
| 3.3.2 突变位点的选择 | 第56-58页 |
| 3.3.3 突变引物设计 | 第58页 |
| 3.3.4 定点突变PCR反应体系 | 第58-59页 |
| 3.3.5 突变子的构建 | 第59-60页 |
| 3.3.6 突变文库的筛选 | 第60页 |
| 3.3.7 突变酶的表达、纯化及酶学参数的测定 | 第60页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第60-66页 |
| 3.4.1 定点突变PCR扩增结果 | 第60页 |
| 3.4.2 S307位点饱和突变文库的筛选与鉴定 | 第60-61页 |
| 3.4.3 S307N突变酶的分离与纯化 | 第61页 |
| 3.4.4 S307N突变酶的性质鉴定 | 第61-64页 |
| 3.4.5 突变N-T的构建 | 第64-65页 |
| 3.4.6 D88位点饱和突变文库的构建、筛选及突变子的鉴定 | 第65-66页 |
| 3.5 位点分析 | 第66-67页 |
| 3.6 小结 | 第67-70页 |
| 第四章 结论与展望 | 第70-74页 |
| 4.1 结论 | 第70-71页 |
| 4.2 展望 | 第71-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 作者简介 | 第80页 |