| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 文献综述 | 第14-29页 |
| 1.1 活的但非可培养状态菌的研究 | 第14-20页 |
| 1.1.1 VBNC状态菌的正式提出 | 第14-16页 |
| 1.1.2 VBNC状态菌的形成及作用机理 | 第16-17页 |
| 1.1.3 VBNC菌的复苏可培养化 | 第17-19页 |
| 1.1.4 环境中VBNC状态菌功能的应用 | 第19-20页 |
| 1.2 复苏促进因子的研究进展 | 第20-24页 |
| 1.2.1 Rpf的发现 | 第21-22页 |
| 1.2.2 Rpf的作用机理 | 第22-23页 |
| 1.2.3 Rpf的应用 | 第23-24页 |
| 1.3 原核微生物新种发掘、系统与分类 | 第24-27页 |
| 1.3.1 细菌“种”的定义 | 第24-25页 |
| 1.3.2 细菌多相分类学鉴定 | 第25-27页 |
| 1.3.2.1 基因型鉴定 | 第25-26页 |
| 1.3.2.2 表型特征鉴定 | 第26-27页 |
| 1.4 选题的理论意义和实际意义 | 第27页 |
| 1.4.1 选题的理论意义 | 第27页 |
| 1.4.2 选题的实际意义 | 第27页 |
| 1.5 研究内容及目的 | 第27-29页 |
| 2 Micrococcus luteus Rpf蛋白质的异源表达 | 第29-51页 |
| 2.1 引言 | 第29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-32页 |
| 2.2.1 试剂与仪器 | 第29-32页 |
| 2.2.1.1 主要试剂 | 第29-30页 |
| 2.2.1.2 主要实验仪器设备 | 第30-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-45页 |
| 2.3.1 细菌的培养 | 第32页 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌的培养 | 第32页 |
| 2.3.1.2 Micrococcus luteus的培养 | 第32页 |
| 2.3.2 质粒DNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.3.3 Micrococcus luteus基因组的抽提 | 第33-34页 |
| 2.3.4 目的基因进行PCR反应体系扩增 | 第34页 |
| 2.3.4.1 PCR反应体系及Rpf基因电泳验证 | 第34页 |
| 2.3.4.2 PCR反应条件 | 第34页 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第34-35页 |
| 2.3.6 目的基因纯化 | 第35页 |
| 2.3.7 酶切反应 | 第35-36页 |
| 2.3.7.1 酶切及连接酶反应 | 第35-36页 |
| 2.3.7.2 酶切产物的纯化 | 第36页 |
| 2.3.7.3 连接酶体系 | 第36页 |
| 2.3.8 转化入克隆宿主菌株DH5α中 | 第36-38页 |
| 2.3.8.1 冰浴 | 第36-37页 |
| 2.3.8.2 热激 | 第37页 |
| 2.3.8.3 选取单克隆菌体 | 第37页 |
| 2.3.8.4 PCR扩增与电泳 | 第37-38页 |
| 2.3.9 提取质粒DNA及酶切验证 | 第38-39页 |
| 2.3.10 转化入表达宿主BL21感受态中孵育 | 第39-40页 |
| 2.3.10.1 冰浴 | 第39页 |
| 2.3.10.2 热激 | 第39页 |
| 2.3.10.3 平板培养单菌落与扩大培养 | 第39页 |
| 2.3.10.4 转移至液体培养基中培养 | 第39-40页 |
| 2.3.11 SDS-PAGE凝胶制备及IPTG诱导表达 | 第40-42页 |
| 2.3.11.1 SDS-PAGE凝胶制备 | 第40页 |
| 2.3.11.2 IPTG诱导表达 | 第40-41页 |
| 2.3.11.3 蛋白质诱导表达电泳验证 | 第41页 |
| 2.3.11.4 诱导成功后转接与扩大培养 | 第41-42页 |
| 2.3.12 His标签的重组蛋白的纯化 | 第42-45页 |
| 2.3.12.1 透析袋预处理 | 第42页 |
| 2.3.12.2 裂解液及咪唑Imidazole配制 | 第42页 |
| 2.3.12.3 超声波细胞破碎提取上清 | 第42-43页 |
| 2.3.12.4 SDS-PAGE蛋白质电泳验证 | 第43页 |
| 2.3.12.5 SDS-PAGE平衡层析柱与梯度洗脱及纯化目的蛋白 | 第43-44页 |
| 2.3.12.6 蛋白质电泳验证 | 第44-45页 |
| 2.4 结果与分析 | 第45-48页 |
| 2.4.1 目的基因提取验证 | 第45页 |
| 2.4.2 目的基因转化入克隆宿主DH5α | 第45-46页 |
| 2.4.3 酶切质粒DNA验证 | 第46-47页 |
| 2.4.4 IPTG诱导表达蛋白质电泳验证结果 | 第47页 |
| 2.4.5 纯化Rpf重组蛋白结果 | 第47-48页 |
| 2.5 讨论与本章小结 | 第48-51页 |
| 2.5.1 Rpf蛋白潜在功能探讨 | 第48-49页 |
| 2.5.2 本章小结 | 第49-51页 |
| 3 制药废水VBNC状态菌的复苏及可培养化 | 第51-73页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 实验材料 | 第51-53页 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 | 第51-53页 |
| 3.2.1.1 主要试剂与药品 | 第51-52页 |
| 3.2.1.2 主要实验仪器 | 第52-53页 |
| 3.2.2 样品的采集及环境 | 第53页 |
| 3.2.3 培养基及其组成 | 第53页 |
| 3.3 实验方法 | 第53-59页 |
| 3.3.1 Rpf的制备 | 第53页 |
| 3.3.2 MPN方法计数与平板分离培养VBNC细菌 | 第53-54页 |
| 3.3.3 Rpf与VBNC状态菌效果分析 | 第54-56页 |
| 3.3.3.1 Rpf效果分析 | 第54-55页 |
| 3.3.3.2 VBNC状态菌效果分析 | 第55-56页 |
| 3.3.4 菌株的分离纯化与保存 | 第56-58页 |
| 3.3.4.1 菌液的涂布分离 | 第56-57页 |
| 3.3.4.2 菌种的分离纯化 | 第57页 |
| 3.3.4.3 菌种的扩大培养及鉴定保存 | 第57-58页 |
| 3.3.5 菌株基因组DNA的抽提及电泳验证 | 第58页 |
| 3.3.6 菌株16S rRNA基因PCR扩增 | 第58页 |
| 3.3.7 系统发育树的构建 | 第58-59页 |
| 3.4 结果与分析 | 第59-69页 |
| 3.4.1 制药废水菌株分离结果 | 第59-63页 |
| 3.4.1.1 制药废水分离菌株16S rRNA基因序列比对结果 | 第59-61页 |
| 3.4.1.2 制药废水分离菌株系统发育分析 | 第61-63页 |
| 3.4.2 制药废水VBNC菌系统发育分析 | 第63-69页 |
| 3.4.2.1 Rpf效果评价 | 第63-65页 |
| 3.4.2.2 对VBNC状态革兰氏阴性菌的复苏促进作用 | 第65-66页 |
| 3.4.2.3 对VBNC状态放线菌的复苏促进作用 | 第66-67页 |
| 3.4.2.4 对低G+C革兰氏阳性菌的复苏促进作用 | 第67-68页 |
| 3.4.2.5 对新种的复苏促进作用 | 第68-69页 |
| 3.5 讨论与本章小结 | 第69-73页 |
| 3.5.1 制药废水VBNC状态菌的潜在功能探讨 | 第69-70页 |
| 3.5.1.1 革兰氏阴性菌功能探讨 | 第69-70页 |
| 3.5.1.2 放线菌与低G+C革兰氏阳性菌功能探讨 | 第70页 |
| 3.5.2 本章小结 | 第70-73页 |
| 4 制药废水VBNC状态菌多相分类学鉴定 | 第73-108页 |
| 4.1 引言 | 第73页 |
| 4.2 实验材料 | 第73-75页 |
| 4.2.1 主要实验仪器 | 第73-74页 |
| 4.2.2 样品的采集环境 | 第74页 |
| 4.2.3 菌株的分离及培养 | 第74-75页 |
| 4.2.3.1 培养基及其组成 | 第74-75页 |
| 4.2.3.2 菌株的分离与保藏 | 第75页 |
| 4.2.4 参比菌株 | 第75页 |
| 4.3 实验方法 | 第75-93页 |
| 4.3.1 表型特征研究 | 第75-77页 |
| 4.3.1.1 菌落形态观察 | 第75-76页 |
| 4.3.1.2 细胞形态观察 | 第76页 |
| 4.3.1.3 细菌运动性观察 | 第76页 |
| 4.3.1.4 革兰氏染色 | 第76-77页 |
| 4.3.1.5 透射电镜观察 | 第77页 |
| 4.3.2 生理生化特征鉴定 | 第77-84页 |
| 4.3.2.1 限制因子实验 | 第77-78页 |
| 4.3.2.2 抗生素敏感性实验 | 第78-79页 |
| 4.3.2.3 厌氧生长实验 | 第79-80页 |
| 4.3.2.4 H_2S产生实验 | 第80页 |
| 4.3.2.5 过氧化氢酶实验 | 第80页 |
| 4.3.2.6 氧化酶实验 | 第80页 |
| 4.3.2.7 淀粉水解实验 | 第80-81页 |
| 4.3.2.8 酪蛋白水解实验 | 第81页 |
| 4.3.2.9 酪氨酸水解实验 | 第81页 |
| 4.3.2.10 明胶水解实验 | 第81页 |
| 4.3.2.11 酯酶活性检测实验 | 第81-82页 |
| 4.3.2.12 单一碳源利用实验 | 第82页 |
| 4.3.2.13 酶活性检测实验 | 第82页 |
| 4.3.2.14 生化反应检测实验 | 第82-83页 |
| 4.3.2.15 发酵产酸实验 | 第83-84页 |
| 4.3.3 化学分类学研究 | 第84-87页 |
| 4.3.3.1 脂肪酸成分检测 | 第84页 |
| 4.3.3.2 极性脂成分检测 | 第84-86页 |
| 4.3.3.3 呼吸醌类型检测 | 第86-87页 |
| 4.3.4 基因型特征研究 | 第87-93页 |
| 4.3.4.1 基因组G+C含量测定 | 第87-89页 |
| 4.3.4.2 多位点序列分析 | 第89-90页 |
| 4.3.4.3 16S rRNA基因序列分析及系统树构建 | 第90页 |
| 4.3.4.4 DNA-DNA杂交 | 第90-93页 |
| 4.4 结果与分析 | 第93-105页 |
| 4.4.1 菌株ZYSR67-Z~T表型特征结果 | 第93页 |
| 4.4.2 菌株ZYSR67-Z~T限制因子耐受生长条件 | 第93-95页 |
| 4.4.2.1 菌株ZYSR67-Z~T温度梯度试验 | 第93-94页 |
| 4.4.2.2 菌株ZYSR67-Z~TpH耐受试验 | 第94-95页 |
| 4.4.2.3 菌株ZYSR67-Z~TNaCl浓度耐受试验 | 第95页 |
| 4.4.3 菌株ZYSR67-Z~T的生理生化特征鉴定结果 | 第95-98页 |
| 4.4.3.1 菌株ZYSR67-Z~T抗生素敏感实验结果 | 第95-96页 |
| 4.4.3.2 菌株ZYSR67-Z~T生理生化特性结果 | 第96-98页 |
| 4.4.4 菌株ZYSR67-Z~T的化学分类结果 | 第98-101页 |
| 4.4.4.1 菌株ZYSR67-Z~T脂肪酸成分检测结果 | 第98-100页 |
| 4.4.4.2 菌株ZYSR67-Z~T极性脂成分检测结果 | 第100-101页 |
| 4.4.4.3 菌株ZYSR67-Z~T呼吸醌成分检测结果 | 第101页 |
| 4.4.5 菌株ZYSR67-Z~T基因特征结果 | 第101-105页 |
| 4.4.5.1 菌株ZYSR67-Z~T 16S rRNA基因序列及系统发育树 | 第101-102页 |
| 4.4.5.2 菌株ZYSR67-Z~T多位点序列分析结果 | 第102-105页 |
| 4.4.5.3 菌株ZYSR67-Z~T G+C mol%含量 | 第105页 |
| 4.4.5.5 菌株ZYSR67-Z~T DNA-DNA杂交结果 | 第105页 |
| 4.5 讨论与本章小结 | 第105-108页 |
| 4.5.1 讨论 | 第105-106页 |
| 4.5.2 新种描述 | 第106-107页 |
| 4.5.3 本章小结 | 第107-108页 |
| 5 结论与展望 | 第108-111页 |
| 5.1 结论 | 第108-109页 |
| 5.2 展望 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第125-127页 |
