| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 缩写说明 | 第8-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-20页 |
| 1 水杨酸的发现与生物学功能 | 第13页 |
| 2 水杨酸的合成代谢研究 | 第13-15页 |
| 2.1 ICS路径 | 第14页 |
| 2.2 PAL路径 | 第14-15页 |
| 3 水杨酸的分解代谢研究 | 第15-18页 |
| 3.1 糖基化 | 第15-16页 |
| 3.2 甲基化 | 第16页 |
| 3.3 羟基化 | 第16-17页 |
| 3.4 氨基酸化 | 第17页 |
| 3.5 磺化反应 | 第17-18页 |
| 4 水杨酸代谢的调控 | 第18页 |
| 5 研究的目的意义 | 第18-20页 |
| 第二章 水稻水杨酸合成基因ICS1的功能分析 | 第20-44页 |
| 1 材料与方法 | 第20-33页 |
| 1.1 试验材料 | 第20页 |
| 1.2 供试菌株、载体和酶 | 第20页 |
| 1.3 OsICS1超表达载体的构建 | 第20-26页 |
| 1.3.1 提取水稻RNA | 第21页 |
| 1.3.2 RNA反转录 | 第21页 |
| 1.3.3 OsICS1基因的扩增 | 第21-22页 |
| 1.3.4 OsICS1基因片段的纯化 | 第22-23页 |
| 1.3.5 pCR8载体的获得 | 第23页 |
| 1.3.6 Slic构建入门载体 | 第23-24页 |
| 1.3.7 Gateway BP反应 | 第24-25页 |
| 1.3.8 农杆菌GV3101感受态的转化与PCR鉴定 | 第25页 |
| 1.3.9 拟南芥转基因与转基因苗的筛选 | 第25-26页 |
| 1.4 pMDC163-proOsICS1载体的构建 | 第26-27页 |
| 1.4.1 DNA的提取 | 第26页 |
| 1.4.2 OsICS1启动子的扩增 | 第26页 |
| 1.4.3 pMDC163-proICS1的连接、转化 | 第26页 |
| 1.4.4 水稻转基因 | 第26-27页 |
| 1.4.5 GUS染色 | 第27页 |
| 1.5 CRISPR Cas9-gRNA载体的构建 | 第27-29页 |
| 1.5.1 靶点gRNA的设计 | 第27-28页 |
| 1.5.2 构建CRISPR Cas9-gRNA质粒 | 第28-29页 |
| 1.6 突变体植株的鉴定 | 第29-31页 |
| 1.6.1 引物的设计 | 第29页 |
| 1.6.2 基因的扩增和酶切 | 第29-30页 |
| 1.6.3 水杨酸含量的测定 | 第30页 |
| 1.6.4 水杨酸含量的检测与分析 | 第30-31页 |
| 1.7 水稻接种白叶枯 | 第31页 |
| 1.8 OsICS1受水杨酸诱导后的表达分析 | 第31-32页 |
| 1.8.1 水杨酸处理 | 第31页 |
| 1.8.2 OsICS1表达量的检测 | 第31-32页 |
| 1.9 OsICS1在烟草中的瞬时表达 | 第32页 |
| 1.10 系统发育进化树分析 | 第32-33页 |
| 2 结果与分析 | 第33-41页 |
| 2.1 OsICS1进化树 | 第34页 |
| 2.2 互补转基因植株的表型和代谢分析 | 第34-35页 |
| 2.3 蛋白结构分析 | 第35-36页 |
| 2.4 水稻ICS1的组织定位 | 第36-37页 |
| 2.5 衰老诱导后OsICS1的表达分析 | 第37-38页 |
| 2.6 OsICS1受激素诱导后表达模式分析 | 第38-39页 |
| 2.7 CRISPR Cas9技术创制突变体Osics1 | 第39页 |
| 2.8 ics1突变体的代谢分析 | 第39-40页 |
| 2.9 ics1突变体中水杨酸响应基因的表达分析 | 第40-41页 |
| 2.10 ics1突变体氧化表型分析 | 第41页 |
| 3 讨论 | 第41-44页 |
| 3.1 OsICS1的互补转基因植株的遗传学和代谢分析 | 第42页 |
| 3.2 突变体的制备和代谢分析 | 第42-43页 |
| 3.3 突变体的氧化表型分析 | 第43页 |
| 3.4 抗病性分析 | 第43-44页 |
| 第三章 水稻水杨酸羟基化代谢基因S5H的功能分析 | 第44-68页 |
| 1 材料与方法 | 第44-51页 |
| 1.1 试验材料 | 第44页 |
| 1.2 供试菌株、载体和酶 | 第44页 |
| 1.3 pMDC43-OsS5H-1/OsS5H-2载体的构建 | 第44页 |
| 1.3.1 OsS5H-1和OsS5H-2基因的扩增 | 第44页 |
| 1.3.2 OsS5H-1和OsS5H-2载体的构建 | 第44页 |
| 1.4 CRISPR Cas9/gRNA载体的构建 | 第44页 |
| 1.5 pMAL-OsS5H-1和pET28a-OsS5H-2载体的构建 | 第44-46页 |
| 1.5.1 OsS5H-1和OsS5H-2基因扩增 | 第45页 |
| 1.5.2 基因和载体的酶切、纯化 | 第45页 |
| 1.5.3 载体和基因的连接 | 第45页 |
| 1.5.4 质粒的转化与验证 | 第45-46页 |
| 1.6 pMAL-OsS5H-1蛋白表达纯化 | 第46页 |
| 1.7 pET28a-OsS5H-2蛋白表达纯化 | 第46-47页 |
| 1.8 蛋白浓度的测定 | 第47-48页 |
| 1.8.1 标准曲线的绘制 | 第47-48页 |
| 1.8.2 重组蛋白浓度的测定 | 第48页 |
| 1.9 酶活的测定 | 第48-49页 |
| 1.10 pMDC163-proS5H-1/proS5H-2载体的构建和GUS染色 | 第49页 |
| 1.10.1 载体的构建 | 第49页 |
| 1.10.2 GUS染色 | 第49页 |
| 1.11 激素处理日本晴 | 第49页 |
| 1.12 实时荧光定量PCR检测OsS5H-1、OsS5H-2的表达 | 第49-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-65页 |
| 2.1 系统进化树的构建 | 第51-52页 |
| 2.2 蛋白的序列分析 | 第52-53页 |
| 2.3 酶的生化活性 | 第53-56页 |
| 2.4 OsS5H-1和OsS5H-2互补转基因植株的表型和代谢分析 | 第56-57页 |
| 2.5 OsS5H-1和OsS5H-2的亚细胞定位分析 | 第57-58页 |
| 2.6 衰老诱导后OsS5H-1和OsS5H-2的表达分析 | 第58-59页 |
| 2.7 OsS5H-1和OsS5H-2的激素诱导表达分析 | 第59-60页 |
| 2.8 s5h-1和s5h-2突变体的创制 | 第60-62页 |
| 2.9 超表达转基因植株的获得 | 第62页 |
| 2.10 突变体和超表达转基因植株水杨酸代谢的测定 | 第62-63页 |
| 2.11 转基因植株的农艺性状和抗病性分析 | 第63-65页 |
| 3 讨论 | 第65-68页 |
| 3.1 候选基因的体外羟基化功能 | 第65-66页 |
| 3.2 OsS5H-1、OsS5H-2的转基因植株遗传学和代谢分析 | 第66页 |
| 3.3 OsS5H-1、OsS5H-2亚细胞定位及诱导表达分析 | 第66-67页 |
| 3.4 OsS5H-1、OsS5H-2受SA和衰老诱导后的表达分析 | 第67页 |
| 3.5 抗病性分析 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 附录 | 第74-76页 |
| 1 培养基的配置 | 第74页 |
| 2 缓冲液的配置 | 第74-76页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-79页 |
