| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 1 文献综述 | 第11-19页 |
| 1.1 副溶血弧菌对石斑鱼的危害 | 第11-12页 |
| 1.2 Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)家族介绍 | 第12-17页 |
| 1.2.1 TLRs的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.2.2 TLRs介导的信号通路 | 第13-15页 |
| 1.2.3 TLR13的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.3 自杀质粒同源重组技术 | 第17页 |
| 1.4 本文研究的目的及意义 | 第17-19页 |
| 2 筛选斜带石斑鱼TLR13参与识别的副溶血弧菌组分 | 第19-30页 |
| 2.1 引言 | 第19页 |
| 2.2 材料与方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 实验菌株及细胞系 | 第19页 |
| 2.2.2 实验药品和试剂 | 第19页 |
| 2.2.3 实验试剂和培养基的配制 | 第19-20页 |
| 2.2.4 仪器设备 | 第20页 |
| 2.2.5 副溶血弧菌活化及扩培 | 第20页 |
| 2.2.6 副溶血弧菌总RNA提取 | 第20-21页 |
| 2.2.7 副溶血弧菌DNA提取 | 第21-22页 |
| 2.2.8 副溶血弧菌鞭毛蛋白(flagellin)提取 | 第22页 |
| 2.2.9 细胞复苏 | 第22页 |
| 2.2.10 细胞传代 | 第22-23页 |
| 2.2.11 细胞刺激 | 第23页 |
| 2.2.12 GS细胞各样品cDNA模板的制备 | 第23-24页 |
| 2.2.13 实时荧光定量PCR(Real-timePCR) | 第24-25页 |
| 2.3 结果 | 第25-27页 |
| 2.3.1 副溶血弧菌不同组分刺激斜带石斑鱼GS细胞后引起的TLR13基因表达模式的变化 | 第25-27页 |
| 2.3.2 VP-RNA刺激斜带石斑鱼GS细胞3h、6h、9h后TLR13基因表达模式的变化 | 第27页 |
| 2.4 讨论 | 第27-29页 |
| 2.5 小结 | 第29-30页 |
| 3 TLR13敲降后对VP-RNA介导产生的细胞因子的影响 | 第30-36页 |
| 3.1 引言 | 第30页 |
| 3.2 材料与方法 | 第30-33页 |
| 3.2.1 实验细胞系 | 第30页 |
| 3.2.2 实验药品和试剂 | 第30-31页 |
| 3.2.3 实验试剂和培养基的配制 | 第31页 |
| 3.2.4 仪器设备 | 第31页 |
| 3.2.5 细胞传代 | 第31页 |
| 3.2.6 转染TLR13-siRNA后,斜带石斑鱼GS细胞中TLR13基因的表达变化 | 第31-32页 |
| 3.2.7 转染TLR13-siRNA后,在VP-RNA刺激下,TLR13信号通路下游细胞因子的表达变化 | 第32页 |
| 3.2.8 GS细胞各样品cDNA模板的制备 | 第32-33页 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) | 第33页 |
| 3.3 结果 | 第33-34页 |
| 3.3.1 转染TLR13-siRNA对斜带石斑鱼GS细胞TLR13基因的表达影响 | 第33页 |
| 3.3.2 转染TLR13-siRNA后,VP-RNA刺激对斜带石斑鱼GS细胞TLR13信号通路下游细胞因子的表达影响 | 第33-34页 |
| 3.4 讨论 | 第34-35页 |
| 3.5 小结 | 第35-36页 |
| 4 构建副溶血弧菌23SrRNA上TLR13识别位点缺失突变菌株 | 第36-52页 |
| 4.1 引言 | 第36页 |
| 4.2 材料与方法 | 第36-44页 |
| 4.2.1 实验用菌株、质粒及细胞系 | 第36-37页 |
| 4.2.2 实验药品和试剂 | 第37-38页 |
| 4.2.3 实验试剂和培养基的配制 | 第38-39页 |
| 4.2.4 仪器设备 | 第39页 |
| 4.2.5 细胞传代 | 第39页 |
| 4.2.6 转染TLR13-siRNA后,在VP13刺激下,TLR13信号通路下游细胞因子的表达变化 | 第39页 |
| 4.2.7 GS细胞各样品的cDNA模板的制备 | 第39-40页 |
| 4.2.8 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) | 第40页 |
| 4.2.9 E.coli S17-1λpir感受态细胞的制备 | 第40页 |
| 4.2.10 pDS132质粒扩培 | 第40页 |
| 4.2.11 pDS132质粒提取 | 第40-41页 |
| 4.2.12 副溶血弧菌突变株的构建 | 第41-44页 |
| 4.3 结果 | 第44-49页 |
| 4.3.1 VP13刺激斜带石斑鱼GS细胞后对TLR13基因的表达影响 | 第44-46页 |
| 4.3.2 转染TLR13-siRNA后,VP13的刺激对斜带石斑鱼GS细胞TLR13信号通路下游细胞因子的表达影响 | 第46-47页 |
| 4.3.3 副溶血弧菌突变株构建结果 | 第47-49页 |
| 4.4 讨论 | 第49-51页 |
| 4.5 小结 | 第51-52页 |
| 总结与展望 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| 附录Ⅰ 缩略词 | 第59-61页 |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间主要研究成果 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
