| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 引言 | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-23页 |
| 1.1 蛋白酶K的研究进展 | 第10-15页 |
| 1.1.1 蛋白酶K的发现 | 第10页 |
| 1.1.2 蛋白酶K的分子生物学研究 | 第10-11页 |
| 1.1.3 蛋白酶K的酶学特性 | 第11-12页 |
| 1.1.4 蛋白酶K的应用 | 第12-14页 |
| 1.1.5 蛋白酶K的生产现状及研究进展 | 第14-15页 |
| 1.2 酵母表达系统 | 第15-21页 |
| 1.2.1 酵母表达系统的优点 | 第15-16页 |
| 1.2.2 毕赤酵母的生物学特性 | 第16页 |
| 1.2.3 巴斯德毕赤酵母表达系统宿主菌 | 第16-17页 |
| 1.2.4 毕赤酵母表达系统载体种类 | 第17-20页 |
| 1.2.5 影响外源基因高效表达的因素 | 第20-21页 |
| 1.3 本实验的研究目的及意义 | 第21-23页 |
| 2 目的基因的获得及pPIC9K-ProK表达载体的构建 | 第23-32页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料与试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.1 材料和试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第24页 |
| 2.2.3 主要溶液剂配制方法 | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-28页 |
| 2.3.1 蛋白酶K密码子的优化及人工合成 | 第24-25页 |
| 2.3.2 pPIC9K载体及目的基因的双酶切 | 第25页 |
| 2.3.3 酶切产物的回收 | 第25-26页 |
| 2.3.4 pPIC9K载体与目的基因的连接 | 第26页 |
| 2.3.5 E.coli DH5a感受态的制备 | 第26-27页 |
| 2.3.6 连接产物的转化及鉴定 | 第27-28页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第28-31页 |
| 2.4.1 优化后蛋白酶K密码子序列 | 第28-29页 |
| 2.4.2 pPIC9K-ProK表达载体的构建及鉴定 | 第29-31页 |
| 2.5 小结 | 第31-32页 |
| 3 蛋白酶K在毕赤酵母中的分泌表达及条件优化 | 第32-52页 |
| 3.1 前言 | 第32页 |
| 3.2 实验材料与试剂 | 第32-34页 |
| 3.2.1 材料与试剂 | 第32页 |
| 3.2.2 主要实验仪器 | 第32-33页 |
| 3.2.3 主要试剂及配制方法 | 第33-34页 |
| 3.3 实验方法 | 第34-43页 |
| 3.3.1 pPIC9K-ProK质粒的线性化及质粒的纯化 | 第34-35页 |
| 3.3.2 毕赤酵母感受态的制备及转化 | 第35-36页 |
| 3.3.3 高拷贝阳性转化子的筛选及PCR鉴定 | 第36-37页 |
| 3.3.4 蛋白酶K的SDS-PAGE电泳鉴定及Western Blot分析 | 第37-40页 |
| 3.3.5 蛋白酶K活性测定 | 第40-41页 |
| 3.3.6 摇瓶中蛋白酶K表达条件的优化 | 第41-42页 |
| 3.3.7 发酵罐中蛋白酶K的诱导表达及浓度测定 | 第42-43页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第43-51页 |
| 3.4.1 毕赤酵母的电转化及阳性高拷贝转化子的筛选 | 第43-45页 |
| 3.4.2 蛋白酶K的SDS-PAGE电泳鉴定及活性测定 | 第45-46页 |
| 3.4.3 蛋白酶K样品的Western Blot分析 | 第46页 |
| 3.4.4 诱导时间对蛋白酶K表达量的影响 | 第46-47页 |
| 3.4.5 诱导剂浓度对蛋白酶K表达量的影响 | 第47-48页 |
| 3.4.6 诱导pH对蛋白酶K表达的影响 | 第48-49页 |
| 3.4.7 诱导温度对蛋白酶K表达量的影响 | 第49-50页 |
| 3.4.8 发酵罐发酵表达蛋白酶K | 第50-51页 |
| 3.5 小结 | 第51-52页 |
| 4 蛋白酶K的分离纯化 | 第52-60页 |
| 4.1 引言 | 第52页 |
| 4.2 实验材料与试剂 | 第52-53页 |
| 4.2.1 材料和试剂 | 第52页 |
| 4.2.2 主要实验仪器 | 第52-53页 |
| 4.2.3 主要溶液及配制方法 | 第53页 |
| 4.3 实验方法 | 第53-56页 |
| 4.3.1 硫酸铵梯度沉淀 | 第53页 |
| 4.3.2 透析 | 第53页 |
| 4.3.3 Ni-NTA亲和层析柱层析 | 第53-54页 |
| 4.3.4 SDS-PAGE电泳分析 | 第54-55页 |
| 4.3.5 三种纯化方法对蛋白酶K的纯化 | 第55页 |
| 4.3.6 纯化后样品收率及比活的测定 | 第55-56页 |
| 4.3.7 菌株遗传稳定性分析 | 第56页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第56-59页 |
| 4.4.1 蛋白酶K的硫酸铵梯度沉淀 | 第56页 |
| 4.4.2 Ni-NTA亲和层析分离蛋白酶K | 第56-57页 |
| 4.4.3 三种纯化方法的比较 | 第57-58页 |
| 4.4.4 菌株遗传稳定性分析 | 第58-59页 |
| 4.5 小结 | 第59-60页 |
| 结论与展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录A 优化前后蛋白酶K基因序列比较及氨基酸序列 | 第67-68页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
