| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 第一部分 实验研究 | 第11-41页 |
| 第一章 pKlrkt打靶载体的构建 | 第11-26页 |
| 前言 | 第11-12页 |
| 1 试剂和设备 | 第12页 |
| 1.1 实验试剂和材料 | 第12页 |
| 1.2 仪器和设备 | 第12页 |
| 2 方法 | 第12-18页 |
| 2.1 牛胎儿成纤维细胞基因组DNA的提取 | 第12-13页 |
| 2.2 角蛋白18 (KRT18)基因同源臂的获取 | 第13-14页 |
| 2.3 同源臂的PCR扩增鉴定和一代基因测序比对分析 | 第14-15页 |
| 2.4 基础载体pGlrkt-1去除CAG启动子改造 | 第15-16页 |
| 2.5 3'同源臂连入基础载体 | 第16-17页 |
| 2.6 5'同源臂连入基础载体 | 第17-18页 |
| 2.7 pKlrkt基础载体的脂质体转染鉴定 | 第18页 |
| 3 结果 | 第18-23页 |
| 3.1 基础载体pGlrkt-1去除启动子的结果 | 第18-19页 |
| 3.2 同源臂扩增结果 | 第19页 |
| 3.3 质粒构建结果 | 第19页 |
| 3.4 pKlrkt载体鉴定结果 | 第19-23页 |
| 4 讨论 | 第23-24页 |
| 参考文献 | 第24-26页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9介导GFP基因在牛KRT18位点的定点整合 | 第26-40页 |
| 前言 | 第26-27页 |
| 1 试剂和设备 | 第27-28页 |
| 1.1 实验试剂和材料 | 第27页 |
| 1.2 仪器设备 | 第27-28页 |
| 2 方法 | 第28-33页 |
| 2.1 CRISPR/Cas9载体的构建 | 第28页 |
| 2.2 打靶细胞的制备和筛选 | 第28-30页 |
| 2.3 基因组的提取 | 第30-31页 |
| 2.3.1 细胞裂解液的配制[21]: | 第30-31页 |
| 2.3.2 基因组的提取 | 第31页 |
| 2.4 转基因细胞的鉴定 | 第31-33页 |
| 3 结果 | 第33-36页 |
| 3.1 电转染条件的优化 | 第33-34页 |
| 3.2 同源臂RT-PCR鉴定结果 | 第34-36页 |
| 4 讨论 | 第36-37页 |
| 5 结论 | 第37-38页 |
| 参考文献 | 第38-40页 |
| 实验总结 | 第40-41页 |
| 第二部分 文献综述 KRT18蛋白研究进展 | 第41-52页 |
| 前言 | 第41页 |
| 1 角蛋白18 (KRT18)的功能特点 | 第41-42页 |
| 2 角蛋白18(KRT18)的调节机理 | 第42-43页 |
| 2.1 角蛋白18 (KRT18)发挥调节机理的功能 | 第42-43页 |
| 2.2 早期胚胎中牛和小鼠KRT18的表达 | 第43页 |
| 3 KRT18对胚胎分化作用的影响 | 第43-44页 |
| 3.1 KRT18随着小鼠妊娠期的变化而变化 | 第43-44页 |
| 3.2 KRT18对牛囊胚和囊胚发育的作用 | 第44页 |
| 4 细胞角蛋白18(KRT18)与疾病 | 第44-46页 |
| 4.1 细胞角蛋白18(KRT18)与癌症 | 第44-45页 |
| 4.1.1 细胞角蛋白18 (KRT18)与肝癌 | 第44-45页 |
| 4.1.2 细胞角蛋白18 (KRT18)与乳腺癌 | 第45页 |
| 4.1.3 细胞角蛋白18 (KRT18)与胃癌 | 第45页 |
| 4.1.4 细胞角蛋白18 (KRT18)与预后标记物 | 第45页 |
| 4.2 细胞角蛋白18 (KRT18)与白血病相关蛋白 | 第45-46页 |
| 5 相关研究技术 | 第46页 |
| 6 存在的问题 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-52页 |
| 致谢 | 第52页 |
