| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 引言 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-28页 |
| 1.1 先天性免疫 | 第16页 |
| 1.2 无脊椎动物先天免疫机制 | 第16-22页 |
| 1.2.1 非己识别 | 第17-22页 |
| 1.2.1.1 肽聚糖识别蛋白 | 第17-18页 |
| 1.2.1.2 含硫酯键蛋白 | 第18-19页 |
| 1.2.1.3 革兰氏阴性菌结合蛋白 | 第19-20页 |
| 1.2.3.4 清除受体 | 第20页 |
| 1.2.3.5 C型凝集素 | 第20-21页 |
| 1.2.3.6 硫依赖型凝集素 | 第21-22页 |
| 1.2.3.7 血素 | 第22页 |
| 1.2.3.8 Toll样受体 | 第22页 |
| 1.3 哺乳动物Toll样受体 | 第22-26页 |
| 1.3.1 Toll-like receptors（TLRs） | 第22-23页 |
| 1.3.2 TLR信号转导途径 | 第23-25页 |
| 1.3.3 TLRs抗感染途径研究 | 第25-26页 |
| 1.3.3.1 TLRs抗菌反应 | 第25页 |
| 1.3.3.2 TLRs抗病毒反应 | 第25-26页 |
| 1.4 海洋生物Toll受体研究 | 第26-27页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第27-28页 |
| 第二章 Toll9原核表达和结合特性分析 | 第28-54页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-33页 |
| 2.1.1 实验样品 | 第28页 |
| 2.1.2 实验菌株和载体 | 第28-29页 |
| 2.1.3 主要试剂和耗材 | 第29页 |
| 2.1.4 缓冲液和实验试剂配制 | 第29-31页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第31-32页 |
| 2.1.6 软件和分析工具 | 第32-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-44页 |
| 2.2.1 实验样品处理 | 第33页 |
| 2.2.2 总RNA的提取 | 第33页 |
| 2.2.3 cDNA的合成 | 第33-34页 |
| 2.2.4 斑节对虾Toll9基因的克隆 | 第34-37页 |
| 2.2.5 表达载体的构建 | 第37-40页 |
| 2.2.6 原核表达 | 第40-43页 |
| 2.2.6.1 IPTG诱导蛋白表达 | 第40页 |
| 2.2.6.2 自诱导表达系统 | 第40-41页 |
| 2.2.6.3 SDS-PAGE | 第41-43页 |
| 2.2.7 重组蛋白的结合活性分析 | 第43页 |
| 2.2.8 微生物刺激表达谱分析 | 第43-44页 |
| 2.3 结果与分析 | 第44-50页 |
| 2.3.1 PmToll9生物信息学分析 | 第44-46页 |
| 2.3.1.1 构建进化树 | 第44-45页 |
| 2.3.1.2 PmToll9空间构型 | 第45-46页 |
| 2.3.2 原核表达 | 第46-48页 |
| 2.3.3 Toll9-ED对细菌的结合效果 | 第48页 |
| 2.3.4 Toll9-ED对PAMPs的体外结合活性 | 第48-49页 |
| 2.3.5PmToll9 mRNA对细菌的响应 | 第49-50页 |
| 2.4 讨论 | 第50-54页 |
| 第三章 Toll9对哺乳动物TLR信号通路的诱导表达 | 第54-76页 |
| 3.1 实验材料 | 第54-55页 |
| 3.1.1 细胞培养 | 第54-55页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第55页 |
| 3.2 实验方法 | 第55-66页 |
| 3.2.1 载体构建 | 第55-56页 |
| 3.2.2 PmToll9真核细胞免疫模型构建 | 第56-58页 |
| 3.2.2.1 细胞转染 | 第56页 |
| 3.2.2.2 双荧光素酶报告系统 | 第56-58页 |
| 3.2.3 PmToll9重组蛋白表达检测 | 第58-59页 |
| 3.2.4 酶联免疫吸附测定 | 第59-60页 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR | 第60-62页 |
| 3.2.6 PmToll9在Hela细胞中的定位 | 第62-63页 |
| 3.2.6.1 重组荧光蛋白转染 | 第62页 |
| 3.2.6.2 DAPI核染色 | 第62-63页 |
| 3.2.7 缺失突变体构建 | 第63-65页 |
| 3.2.8 缺失突变体表达变化 | 第65-66页 |
| 3.3 结果与分析 | 第66-72页 |
| 3.3.1 真核细胞免疫模型构建 | 第66页 |
| 3.3.2 PmToll9对TLR通路信号调控作用 | 第66-69页 |
| 3.3.2.1 PmToll9激活NF-κB | 第66-67页 |
| 3.3.2.2 PmToll9激活TLR信号通路因子表达 | 第67-68页 |
| 3.3.2.3 PmToll9促进TNF-α表达释放 | 第68-69页 |
| 3.3.3 LRR缺失削弱PmToll9表达水平 | 第69-70页 |
| 3.3.4 PmToll9细胞定位 | 第70-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-76页 |
| 第四章 Toll9在果蝇Toll通路中的激活表达 | 第76-94页 |
| 4.1 材料和方法 | 第76-77页 |
| 4.1.1 仪器与设备 | 第76页 |
| 4.1.2 材料与试剂 | 第76-77页 |
| 4.1.3 分析软件 | 第77页 |
| 4.2 实验方法 | 第77-81页 |
| 4.2.1 果蝇S2细胞培养 | 第77-78页 |
| 4.2.2 载体构建 | 第78页 |
| 4.2.3 双荧光素酶报告系统 | 第78-79页 |
| 4.2.3.1 报告质粒的筛选 | 第78-79页 |
| 4.2.3.2 转染浓度梯度 | 第79页 |
| 4.2.4 免疫刺激 | 第79-80页 |
| 4.2.5 荧光定量实验 | 第80-81页 |
| 4.2.6 数据分析 | 第81页 |
| 4.3 结果与分析 | 第81-89页 |
| 4.3.1 Toll9-LRRs结构分析 | 第81-82页 |
| 4.3.2 PmToll9激活对虾和果蝇抗菌肽 | 第82-83页 |
| 4.3.3 PmToll9对果蝇Toll通路的激活效应 | 第83-85页 |
| 4.3.3.1 最适转染量筛选 | 第83页 |
| 4.3.3.2 PmToll9激活Toll信号通路相关因子表达 | 第83-85页 |
| 4.3.4 PAMPs激活PmToll9表达和信号转导 | 第85-86页 |
| 4.3.5 LRR缺失突变体影响PmToll9功能 | 第86-88页 |
| 4.3.6 PmToll9介导的信号转导机制 | 第88-89页 |
| 4.4 讨论 | 第89-94页 |
| 结论 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-107页 |
| 附录 | 第107-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
