| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 符号与缩略语说明 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-40页 |
| 1 氯代乙酰胺类除草剂 | 第18-25页 |
| ·氯代乙酰胺类除草剂的作用机理 | 第19页 |
| ·氯代乙酰胺类除草剂对环境和农业生产的影响 | 第19-20页 |
| ·氯代乙酰胺类除草剂在环境中的降解过程 | 第20-25页 |
| 2 乙草胺生物降解代谢途径中的关键酶 | 第25-31页 |
| ·催化N-脱烷基起始反应的氧化酶 | 第25-28页 |
| ·CMEPA水解酶研究进展 | 第28-31页 |
| 3 氯代乙酰胺除草剂降解基因在转基因作物中的应用 | 第31页 |
| 4 当前研究存在的问题及立题依据 | 第31-32页 |
| 参考文献 | 第32-40页 |
| 第二章 Delftia sp.T3-6菌株CMEPA水解酶的纯化 | 第40-66页 |
| 第一节 CMEPA水解产物定量测定方法研究 | 第41-49页 |
| 1 材料与方法 | 第41-42页 |
| ·试剂 | 第41页 |
| ·仪器 | 第41页 |
| ·4-氨基安替比林显色法测定MEA含量的研究 | 第41-42页 |
| ·4-氨基安替比林显色法检测苯胺、苯酚及其衍生物 | 第42页 |
| 2 结果与分析 | 第42-49页 |
| ·MEA与4-氨基安替比林显色反应可见光波段扫描结果 | 第42-43页 |
| ·MEA最低检测限及标准曲线 | 第43页 |
| ·温度对显色反应的影响 | 第43-44页 |
| ·pH对显色反应的影响 | 第44-45页 |
| ·化学试剂对显色反应的影响 | 第45-47页 |
| ·苯胺、苯酚及其衍生物的检测 | 第47-49页 |
| 第二节 Delftia sp.T3-6菌株粗酶液特性研究 | 第49-54页 |
| 1 材料与方法 | 第49-51页 |
| ·材料与仪器 | 第49页 |
| ·菌株Delftia sp.T3-6培养和粗酶液的制备 | 第49页 |
| ·酶活测定 | 第49-50页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第50页 |
| ·pH对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性和稳定性的影响 | 第50页 |
| ·温度对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性和稳定性的影响 | 第50页 |
| ·金属离子对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性的影响 | 第50页 |
| ·有机溶剂对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性的影响 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-54页 |
| ·pH对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性和稳定性的影响 | 第51页 |
| ·温度对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性和稳定性的影响 | 第51-52页 |
| ·金属离子对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性的影响 | 第52-53页 |
| ·有机溶剂、螯合剂及表面活性剂对Delftia sp.T3-6粗酶液CMEPA水解活性的影响 | 第53-54页 |
| 第三节 Delftia sp.T3-6菌株CMEPA水解酶的纯化 | 第54-61页 |
| 1 材料与方法 | 第54-56页 |
| ·材料 | 第54页 |
| ·酶活测定 | 第54页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第54页 |
| ·硫酸铵分级沉淀 | 第54-55页 |
| ·DEAE-Sepharose fast flow离子柱层析 | 第55页 |
| ·Butyl-650M疏水交换层析 | 第55页 |
| ·Superdex G-200凝胶层析 | 第55页 |
| ·SDS-PAGE电泳及酶谱分析 | 第55-56页 |
| ·肽指纹图谱鉴定与蛋白质N端测序 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-61页 |
| ·CMEPA水解酶硫酸铵分级沉淀 | 第56-57页 |
| ·CMEPA水解酶DEAE-Sepharose fast flow离子柱层析分离 | 第57页 |
| ·CMEPA水解酶Butyl-650M疏水柱层析分离 | 第57-58页 |
| ·CMEPA水解酶Superdex G-200凝胶层析结果 | 第58-60页 |
| ·酶谱分析 | 第60页 |
| ·肽指纹图谱鉴定与蛋白质N端测序 | 第60-61页 |
| 本章讨论 | 第61-63页 |
| 本章小结 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-66页 |
| 第三章 Delftia sp.T3-6菌株CMEPA水解酶基因克隆与重组酶酶学特性研究 | 第66-114页 |
| 第一节 Delftia sp.T3-6 CMEPA水解酶基因克隆 | 第67-86页 |
| 1 材料与方法 | 第67-77页 |
| ·菌株和质粒 | 第67页 |
| ·培养基与试剂 | 第67-68页 |
| ·PCR扩增damH使用引物 | 第68页 |
| ·基因组DNA提取 | 第68-69页 |
| ·质粒的提取 | 第69页 |
| ·普通感受态细胞的制备 | 第69-70页 |
| ·转化感受态细胞 | 第70页 |
| ·damH基因PCR扩增 | 第70-73页 |
| ·表达菌株的构建 | 第73-75页 |
| ·表达菌株的活性验证及测序验证 | 第75-76页 |
| ·damH下游序列的扩增 | 第76页 |
| ·Delftia sp.T3-6对环已醇和ε-已内酯的降解 | 第76-77页 |
| ·序列分析软件、在线分析网址 | 第77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-86页 |
| ·Delftia sp.T3-6总DNA提取 | 第77-78页 |
| ·PCR扩增damH基因 | 第78-79页 |
| ·表达载体pET-29a(+)-damH的构建 | 第79页 |
| ·表达菌株的活性验证 | 第79-81页 |
| ·DamH氨基酸序列分析 | 第81-82页 |
| ·damH下游核酸序列分析 | 第82-83页 |
| ·Delftia sp.T3-6对环已醇和ε-已内酯的降解 | 第83-86页 |
| 第二节 重组酶DamH酶学特性研究 | 第86-96页 |
| 1 材料与方法 | 第86-88页 |
| ·菌株和试剂 | 第86页 |
| ·重组酶DamH的诱导表达 | 第86页 |
| ·重组酶DamH的纯化 | 第86-87页 |
| ·重组酶DamH的底物特异性 | 第87页 |
| ·重组酶DamH对不同底物K_m值和K_(cat)测定 | 第87页 |
| ·温度和pH值对重组酶DamH活性和稳定性的影响 | 第87-88页 |
| ·金属离子对重组酶DamH活性的影响 | 第88页 |
| ·有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶DamH活性的影响 | 第88页 |
| 2 结果与分析 | 第88-96页 |
| ·重组酶DamH的诱导表达 | 第88-89页 |
| ·重组酶DamH纯化 | 第89-90页 |
| ·重组酶DamH底物特异性 | 第90-92页 |
| ·pH和温度对重组酶DamH活性和稳定性的影响 | 第92-93页 |
| ·金属离子对重组酶DamH活性的影响 | 第93-94页 |
| ·有机溶剂、螯合剂、表面活性剂对重组酶DamH活性的影响 | 第94-96页 |
| 第三节 重组酶DamH定点突变与结晶条件研究 | 第96-105页 |
| 1 材料和方法 | 第96-98页 |
| ·菌株 | 第96页 |
| ·仪器与试剂 | 第96页 |
| ·重叠延伸PCR定点突变damH | 第96-97页 |
| ·突变表达菌株诱导表达及突变重组酶的活性测定 | 第97页 |
| ·DamH蛋白质结晶条件筛选及优化 | 第97-98页 |
| 2 结果与分析 | 第98-105页 |
| ·突变表达菌株静息细胞活性检测 | 第98-100页 |
| ·DamH纯化与浓缩 | 第100页 |
| ·DamH结晶条件初筛 | 第100-102页 |
| ·DamH结晶条件优化 | 第102-103页 |
| ·DamH晶体X-射线衍射 | 第103-104页 |
| ·DamH蛋白结构模拟 | 第104-105页 |
| 本章讨论 | 第105-107页 |
| 本章小结 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-114页 |
| 第四章 Rhodococcus sp.T3-1菌株N-脱烷基酶复合体纯化与基因克隆 | 第114-140页 |
| 第一节 Rhodococcus sp.T3-1乙草胺N-脱烷基酶纯化 | 第115-126页 |
| 1 材料与方法 | 第115-118页 |
| ·菌株及仪器 | 第115页 |
| ·破碎方法对Rhodococcus sp.T3-1粗酶液活性的影响 | 第115-116页 |
| ·Rhodococcus sp.T3-1突变株的获得与鉴定 | 第116-117页 |
| ·盐析 | 第117-118页 |
| ·Butyl-650M疏水交换层析 | 第118页 |
| ·肽指纹图谱分析 | 第118页 |
| 2 结果与分析 | 第118-126页 |
| ·破碎方法对Rhodococcus sp.T3-1粗酶液活性的影响 | 第118-119页 |
| ·Rhodococcus sp.T3-1乙草胺N-脱乙氧甲基活性缺陷型的获得与鉴定 | 第119-122页 |
| ·盐析 | 第122-123页 |
| ·Butyl-650M疏水柱层析 | 第123-124页 |
| ·肽指纹图谱分析结果 | 第124-126页 |
| 第二节 Rhodococcus sp.T3-1 N-脱烷基酶基因克隆 | 第126-134页 |
| 1 材料与方法 | 第126-128页 |
| ·菌株、培养基、试剂及仪器 | 第126页 |
| ·PCR扩增使用引物 | 第126-127页 |
| ·质粒的提取 | 第127页 |
| ·普通感受态细胞的制备及转化 | 第127页 |
| ·基因PCR扩增 | 第127页 |
| ·表达载体及表达菌株的构建 | 第127-128页 |
| ·表达菌株诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第128页 |
| ·ethABCD基因簇不同组织形式表达菌株活性测定 | 第128页 |
| ·Rhodococcus sp.T3-1(MT)菌株ethABCD基因簇PCR检验 | 第128页 |
| 2 结果与分析 | 第128-134页 |
| ·ethABCD基因簇的克隆 | 第128-130页 |
| ·表达菌株的构建 | 第130-131页 |
| ·重组酶诱导表达 | 第131-132页 |
| ·不同组织形式的基因簇表达菌株全细胞测活 | 第132-133页 |
| ·PCR检验Rhodococcus sp.T3-1(MT)菌株ethABCD基因簇各组分 | 第133-134页 |
| 本章讨论 | 第134-137页 |
| 本章小结 | 第137-138页 |
| 参考文献 | 第138-140页 |
| 全文总结 | 第140-142页 |
| 主要创新点 | 第142-144页 |
| 下一步工作设想 | 第144-146页 |
| 附录 | 第146-156页 |
| 附录1 培养基和试剂配方 | 第146-149页 |
| 一、培养基 | 第146页 |
| 二、试剂 | 第146-149页 |
| 附录2 核酸和氨基酸序列 | 第149-156页 |
| 一、Delftia sp.T3-6 CMEPA水解酶相关序列 | 第149-150页 |
| 二、Rhodococcus sp.T3-1纯化蛋白肽指纹图谱结果 | 第150-156页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 | 第156-158页 |
| 致谢 | 第158页 |
