| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 前言 | 第13-18页 |
| 第一部分 蚓激酶乳腺组织特异性表达载体的构建及其在山羊奶中的暂时表达 | 第18-33页 |
| 1 材料与方法 | 第18-25页 |
| ·菌种及质粒 | 第18页 |
| ·限制性内切酶和工具酶 | 第18页 |
| ·主要生化试剂 | 第18-19页 |
| ·主要仪器 | 第19页 |
| ·实验动物 | 第19页 |
| ·培养基的配制 | 第19页 |
| ·主要试剂的配制 | 第19-20页 |
| ·DNA目的片段的回收 | 第20-21页 |
| ·DNA片段的连接 | 第21页 |
| ·感受态菌的制备(CaCl_2转化法) | 第21-22页 |
| ·连接物的转化 | 第22页 |
| ·转化菌落的快速鉴定 | 第22页 |
| ·质粒DNA的提取与纯化 | 第22-23页 |
| ·质粒的酶切 | 第23-24页 |
| ·质粒DNA的定量 | 第24页 |
| ·真核表达载体pIRES-bCP的构建 | 第24页 |
| ·真核表达质粒pIbCP-LK-neo的构建 | 第24页 |
| ·真核表达质粒pIbCP-LK-LK的构建 | 第24-25页 |
| ·SDS碱裂解法大提质粒pIbCP-LK-neo及pIbCP-LK-LK | 第25页 |
| ·转染 | 第25页 |
| ·溶圈实验 | 第25页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第25页 |
| 2 结果 | 第25-31页 |
| ·构建出乳腺组织特异性表达载体pIRES-bCP | 第25页 |
| ·构建出含单个蚓激酶基因的真核表达质粒pIbCP-LK-neo | 第25页 |
| ·构建出含双蚓激酶基因的真核表达质粒pIbCP-LK-LK | 第25-29页 |
| ·表达检测 | 第29-31页 |
| 3 讨论 | 第31-33页 |
| 第二部分 蚓激酶基因在Vero细胞及DK细胞上的表达 | 第33-43页 |
| 1 材料与方法 | 第33-38页 |
| ·质粒与菌株 | 第33页 |
| ·限制性内切酶和工具酶 | 第33页 |
| ·主要生化试剂 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33页 |
| ·培养基的配制 | 第33页 |
| ·LB液体、固体培养基的配制同实验一 | 第33页 |
| ·MEM细胞培养基的配制 | 第33页 |
| ·主要试剂的配制 | 第33-34页 |
| ·DNA的常规操作 | 第34页 |
| ·pILK质粒的构建 | 第34-37页 |
| ·pILK质粒的大量制备 | 第37页 |
| ·Vero-dhfr~-细胞及DK-dhfr~-细胞的培养 | 第37页 |
| ·细胞的传代 | 第37页 |
| ·细胞计数 | 第37页 |
| ·Vero-dhfr~-细胞及DK-dhfr~-细胞对G418耐受浓度的测定 | 第37页 |
| ·外源基因转染真核细胞(脂质体介导法) | 第37-38页 |
| ·pILK基因在Vero-dhfr~-细胞及DK-dhfr~-细胞中的暂时表达 | 第38页 |
| 2 结果 | 第38-40页 |
| ·pILK真核表达质粒的构建 | 第38页 |
| ·Vero-dhfr~-胞及Dx-dhfr~-细胞对G418耐受试验 | 第38页 |
| ·pILK在真核细胞中的暂时表达 | 第38页 |
| ·细胞克隆筛选结果 | 第38-40页 |
| 3 讨论 | 第40-43页 |
| 第三部分 PA317-pLNbLK细胞株的建立及蚓激酶逆转录病毒转染山羊乳腺 | 第43-53页 |
| 1 材料与方法 | 第43-47页 |
| ·质粒、菌株、细胞与实验动物 | 第43页 |
| ·限制性内切酶和工具酶 | 第43页 |
| ·主要生化试剂 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·逆转录病毒载体pLNbLK | 第43-45页 |
| ·培养基的配制 | 第45页 |
| ·主要试剂的配制 | 第45页 |
| ·DNA提取缓冲液 | 第45页 |
| ·细胞的培养 | 第45页 |
| ·细胞的传代及计数 | 第45页 |
| ·PA317细胞及NIH3T3细胞对G418耐受浓度的测定 | 第45页 |
| ·pLNbLK反转录病毒表达质粒转染PA317细胞(脂质体介导法) | 第45-46页 |
| ·RT-PCR引物设计 | 第46页 |
| ·真核细胞基因组的提取 | 第46页 |
| ·用PCR方法检测PA317-LK细胞 | 第46页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第46-47页 |
| ·转染及检测 | 第47页 |
| 2 结果 | 第47-51页 |
| ·PA317细胞及NIH3F3细胞对G418耐受浓度 | 第47页 |
| ·pLNbLK反转录病毒表达质粒转染PA317细胞结果 | 第47-49页 |
| ·PA317-LK细胞基因组PCR结果 | 第49页 |
| ·病毒滴度的测定结果 | 第49页 |
| ·转染后检测结果 | 第49-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 附录 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
