| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-27页 |
| 一. 转谷氨酰胺酶的概况 | 第12-13页 |
| 二. 转谷氨酰胺酶的反应机理与酶活测定方法 | 第13-14页 |
| 三. 谷氨酰胺酶的酶学性质 | 第14-15页 |
| 四. 转谷氨酰胺酶的结构 | 第15-19页 |
| 五. 转谷氨酰胺酶的应用 | 第19-22页 |
| 1 微生物转谷氨酰胺酶的应用 | 第19-21页 |
| 2 组织转谷氨酰胺酶的应用 | 第21-22页 |
| 六. 立题意义和背景 | 第22-23页 |
| 七. 本论文研究的主要内容 | 第23页 |
| 参考文献 | 第23-27页 |
| 第二章 目的基因的克隆 | 第27-47页 |
| 一. 引言 | 第27-28页 |
| 二. 材料与方法 | 第28-39页 |
| 1 试剂与仪器 | 第28-32页 |
| ·菌株与质粒 | 第28-29页 |
| ·主要试剂与试剂盒 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29-30页 |
| ·培养基 | 第30-31页 |
| ·主要溶液 | 第31-32页 |
| ·DNA分子量marker | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-39页 |
| ·轮枝链霉菌的培养 | 第32页 |
| ·轮枝链霉菌基因组DNA的提取 | 第32-33页 |
| ·DNA浓度的测定 | 第33页 |
| ·转谷氨酰胺酶基因的扩增 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体的构建 | 第34-37页 |
| ·Pichia Pastoris酵母菌重组表达系统的构建 | 第37-39页 |
| ·DNA测序 | 第39页 |
| 三. 结果与讨论 | 第39-45页 |
| 1 轮枝链霉菌基因组DNA的提取 | 第39-40页 |
| 2 转谷氨酰胺酶基因的扩增 | 第40页 |
| 3 大肠杆菌重组表达载体的构建 | 第40-43页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体pBV220-MTG的构建 | 第40-42页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体pET22b-MTG的构建 | 第42页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体pET30a-MTG的构建 | 第42-43页 |
| 4 Pichia Pastoris酵母菌重组表达系统的构建 | 第43-45页 |
| ·大肠杆菌-酵母菌重组穿梭质粒pPICZαA-MTG的构建 | 第44页 |
| ·获得MTG重组Pichia Pastoris酵母菌 | 第44-45页 |
| 四. 本章小结 | 第45页 |
| 参考文献 | 第45-47页 |
| 第三章 表达载体的筛选 | 第47-61页 |
| 一. 引言 | 第47页 |
| 二. 材料与方法 | 第47-56页 |
| 1 材料 | 第47-49页 |
| ·主要试剂 | 第47-48页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·主要溶液 | 第48-49页 |
| ·蛋白Marker | 第49页 |
| ·酵母菌发酵培养基 | 第49页 |
| 2 实验方法 | 第49-56页 |
| ·大肠杆菌的表达发酵 | 第49-52页 |
| ·大肠杆菌的发酵 | 第50页 |
| ·样品处理 | 第50-52页 |
| ·诱导条件的研究 | 第52页 |
| ·重组酵母菌的表达 | 第52-53页 |
| ·重组酵母菌的发酵 | 第52-53页 |
| ·重组酵母菌的诱导表达 | 第53页 |
| ·酵母菌蛋白的处理 | 第53页 |
| ·重组酵母菌RT-PCR检测 | 第53-56页 |
| ·酵母菌总RNA抽提 | 第53页 |
| ·RT反转录 | 第53-54页 |
| ·PCR扩增 | 第54-56页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第56页 |
| 三. 结果与讨论 | 第56-61页 |
| 1 SDS-PAGE电泳表达鉴定 | 第56-59页 |
| ·pBV220-MTG／Jm109和pBV220-MTG／DH5α的表达 | 第57页 |
| ·pET22b-MTG／BL21(DE3)的表达 | 第57-58页 |
| ·pET30a-MTG／BL21(DE3)的表达 | 第58-59页 |
| ·重组酵母菌的表达 | 第59页 |
| 2 RT-PCR结果 | 第59-60页 |
| 3 重组大肠杆菌pET30a-MTG／BL21(DE3)诱导条件的研究 | 第60-61页 |
| 四. 本章小结 | 第61页 |
| 参考文献 | 第61页 |
| 第四章 目的蛋白的纯化 | 第61-69页 |
| 一. 引言 | 第63页 |
| 二. 材料与方法 | 第63-67页 |
| 1 试剂与仪器 | 第63-65页 |
| ·主要试剂 | 第64页 |
| ·主要仪器 | 第64页 |
| ·主要溶液 | 第64-65页 |
| 2 实验方法 | 第65-67页 |
| ·包涵体的提取 | 第65页 |
| ·透析 | 第65-66页 |
| ·通过Ni离子金属螯合层析纯化蛋白 | 第66页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第66-67页 |
| ·酶液保存鉴定 | 第67页 |
| 三. 结果与讨论 | 第67-68页 |
| 1 蛋白层析结果 | 第67-68页 |
| 2 酶液保存鉴定 | 第68页 |
| 四. 本章小结 | 第68页 |
| 参考文献 | 第68-69页 |
| 第五章 目的蛋白的功能鉴定 | 第69-78页 |
| 一. 引言 | 第69页 |
| 二. 材料与方法 | 第69-75页 |
| 1 试剂与仪器 | 第69-71页 |
| ·主要试剂 | 第69-70页 |
| ·主要仪器 | 第70页 |
| ·主要溶液 | 第70-71页 |
| 2 实验方法 | 第71-75页 |
| ·抗血清的获得 | 第71-72页 |
| ·抗原的制备 | 第71-72页 |
| ·乳化抗原 | 第72页 |
| ·免疫方案 | 第72页 |
| ·血清的分离和保存 | 第72页 |
| ·蛋白免疫活性鉴定 | 第72-73页 |
| ·Dot Blotting实验流程 | 第72-73页 |
| ·Western Bloting实验流程 | 第73页 |
| ·检测蛋白质酶活性 | 第73-75页 |
| ·化学方法(定量) | 第73-74页 |
| ·蛋白交联(定性) | 第74-75页 |
| ·重组酶的酶学性质 | 第75页 |
| ·pH值对重组酶活性的影响 | 第75页 |
| ·温度对重组酶活性的影响 | 第75页 |
| 三. 结果与讨论 | 第75-78页 |
| 1 免疫鉴定 | 第75-76页 |
| ·Dot blotting的结果见下 | 第75页 |
| ·Western Blotting结果如下 | 第75-76页 |
| 2 酶活测定结果 | 第76-77页 |
| ·化学方法 | 第76页 |
| ·催化蛋白交联结果 | 第76-77页 |
| 3 重组酶的酶学性质 | 第77-78页 |
| ·pH值对重组酶活性的影响 | 第77-78页 |
| ·温度对重组酶活性的影响 | 第78页 |
| 四. 本章小结 | 第78页 |
| 参考文献 | 第78-79页 |
| 主要结论 | 第79-80页 |
| 在研期间发表的论文 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
