| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-16页 |
| 专业名词缩写中英文对照表 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-20页 |
| 实验技术路线 | 第20-21页 |
| 第一章 无饲养细胞人类胚胎干细胞体外培养体系的建立 | 第21-49页 |
| 1. 材料 | 第22-23页 |
| ·细胞系 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22-23页 |
| ·主要的仪器设备 | 第23页 |
| 2. 方法 | 第23-32页 |
| ·人类成纤维饲养细胞制备 | 第23-24页 |
| ·NB体系培养皿包被处理 | 第24页 |
| ·FGF2生长因子配制 | 第24页 |
| ·HEF体系下hESCs传代培养 | 第24页 |
| ·NB体系下hESCs传代培养 | 第24-25页 |
| ·未分化克隆百分比 | 第25页 |
| ·hESCs AKP染色 | 第25页 |
| ·hESCs分子标记免疫细胞化学染色 | 第25-26页 |
| ·hESCs RNA抽提 | 第26-27页 |
| ·RNA纯化处理 | 第27页 |
| ·逆转录RT-PCR步骤 | 第27-28页 |
| ·多能性基因半定量PCR检测 | 第28页 |
| ·NB培养体系下hESCs对早期神经发育关键转录因子Pax6和Sox1表达检测 | 第28页 |
| ·hESCs染色体检测 | 第28-29页 |
| ·畸胎瘤形成实验 | 第29页 |
| ·hESCs细胞表面标记物TRA-1-60和SSEA-4流式分析 | 第29-30页 |
| ·hESCs冷冻保存 | 第30-31页 |
| ·hESCs解冻培养 | 第31-32页 |
| 3. 结果 | 第32-36页 |
| ·NB体系下培养的hESCs为未分化状态的hESCs | 第32-34页 |
| ·NB体系hESCs表现出典型的未分化hESCs外观形态 | 第32-33页 |
| ·NB体系下hESCs表达多能性基因 | 第33页 |
| ·NB体系下hESCs不表达早期神经发育关键转录因子 | 第33-34页 |
| ·NB体系下hESCs表达未分化hESCs细胞表面标记物 | 第34页 |
| ·NB体系下长期培养的hESCs保持了正常的染色体核型 | 第34页 |
| ·NB体系下hESCs体内多向分化潜能检测 | 第34页 |
| ·hESCs冷冻和解冻培养 | 第34-35页 |
| ·HEF体系下和NB体系下hESCs TRA-1-60和SSEA-4流式分析 | 第35-36页 |
| 4. 讨论 | 第36-38页 |
| 5. 小结 | 第38-39页 |
| 6. 附图 | 第39-49页 |
| 第二章 有饲养细胞和无饲养细胞培养体系下人类胚胎干细胞比较 | 第49-81页 |
| 1. 材料 | 第49-50页 |
| ·细胞系 | 第49页 |
| ·试剂 | 第49页 |
| ·主要的仪器设备 | 第49-50页 |
| 2. 方法 | 第50-54页 |
| ·HEF体系下和NB体系下hESCs对Rex1,Gbx2和FGF5基因的表达 | 第50页 |
| ·HEF体系下hESCs细胞倍增时间检测 | 第50页 |
| ·NB体系下hESCs细胞倍增时间检测 | 第50-51页 |
| ·细胞周期检测 | 第51-52页 |
| ·细胞凋亡检测 | 第52页 |
| ·HEF体系和NB体系来源的hESCs经EBs自发分化倾向检测 | 第52-53页 |
| ·NB体系下hESCs转回HEF体系后经EBs自发分化倾向检测 | 第53页 |
| ·NB体系下hESCs转回HEF体系后TRA-1-60和SSEA4流式分析 | 第53页 |
| ·HEF体系和NB体系下hESCs形成畸胎瘤评级分析 | 第53-54页 |
| 3. 结果 | 第54-62页 |
| ·hESCs对Rex1,Gbx2和FGF5基因表达 | 第54页 |
| ·hESCs克隆形态 | 第54-55页 |
| ·HEF体系和NB体系下hESCs细胞倍增时间 | 第55-56页 |
| ·细胞凋亡和细胞周期 | 第56页 |
| ·hESCs体外多向分化潜能检测 | 第56-60页 |
| ·NB体系下hESCs转回到HEF体系后FACS分析 | 第60-61页 |
| ·畸胎瘤分化倾向分析 | 第61-62页 |
| 4. 讨论 | 第62-66页 |
| ·HEF和NB体系下hESCs仍处于胚胎发育的内细胞团阶段 | 第62页 |
| ·HEF体系和NB体系下hESCs克隆形态 | 第62-63页 |
| ·NB体系比HEF体系能更加有效扩增hESCs | 第63-64页 |
| ·不同培养体系可影响hESCs分化倾向 | 第64-66页 |
| 5.结论 | 第66-67页 |
| 6. 创新点 | 第67-68页 |
| 7. 附图 | 第68-81页 |
| 第三章 hESCs自分泌维持自身未分化状态 | 第81-100页 |
| 1. 材料 | 第81-82页 |
| ·细胞系 | 第81-82页 |
| ·试剂 | 第82页 |
| ·主要的仪器设备 | 第82页 |
| 2. 方法 | 第82-85页 |
| ·hESCs对Wnts、FGFs、TGFs信号通路家族成员部分配体基因表达 | 第82页 |
| ·HEF体系和NB培养体系BMP样诱导活性检测 | 第82-83页 |
| ·NB体系来源的hESCs无FGF2细胞因子培养 | 第83页 |
| ·无FGF2细胞因子NB体系下hESCs克隆种植密度对维持未分化状态的影响 | 第83页 |
| ·无FGF2细胞因子NB体系下hESCs鉴定 | 第83-84页 |
| ·NB培养体系下,hESCs条件培养基细胞因子测定 | 第84-85页 |
| 3. 结果 | 第85-88页 |
| ·Wnt、TGFbeta和FGF信号通路部分配体基因表达半定量分析 | 第85页 |
| ·NB体系存在较低的BMP样诱导活性,hESCs克隆种植密度可改变该种BMP样诱导活性 | 第85-87页 |
| ·NB体系下hESCs未分化状态的维持不需要外源性的FGF2 | 第87页 |
| ·NB体系下hESCs条件培养基细胞因子测定 | 第87-88页 |
| 4. 讨论 | 第88-90页 |
| 5. 小结 | 第90-91页 |
| 6. 创新点 | 第91-92页 |
| 7. 附图 | 第92-100页 |
| 参考文献 | 第100-103页 |
| 综述 | 第103-109页 |
| 参考文献 | 第107-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 攻读学位期间发表的主要论文 | 第110-111页 |
| 个人简介 | 第111页 |
