| 缩略语表 | 第7-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 文献回顾 | 第17-27页 |
| 第一部分 HSP90AA1促进骨肉瘤化疗药物耐药形成的体外实验研究 | 第27-47页 |
| 1 材料 | 第27-28页 |
| 1.1 细胞系 | 第27页 |
| 1.2 shRNA | 第27页 |
| 1.3 试剂 | 第27-28页 |
| 1.4 设备和仪器 | 第28页 |
| 2 方法 | 第28-35页 |
| 2.1 细胞培养 | 第28页 |
| 2.2 细胞总蛋白提取 | 第28-29页 |
| 2.3 Westernblot实验 | 第29-30页 |
| 2.4 总RNA提取 | 第30-31页 |
| 2.5 HSP90AA1过表达慢病毒感染骨肉瘤细胞 | 第31页 |
| 2.6 实时定量PCR | 第31-32页 |
| 2.7 脂质体介导的shRNA质粒转染 | 第32-33页 |
| 2.8 细胞增殖检测(CCK-8试剂盒) | 第33页 |
| 2.9 细胞凋亡检测(流式细胞仪) | 第33-34页 |
| 2.10 Caspase3活性检测(Caspase3ActivityAssayKit) | 第34-35页 |
| 2.11 统计学分析 | 第35页 |
| 3 结果 | 第35-44页 |
| 3.1 Westernblot检测化疗药物对骨肉瘤细胞中HSP90AA1蛋白表达的影响 | 第35-36页 |
| 3.2 实时定量PCR检测化疗药物对骨肉瘤细胞中HSP90AA1mRNA表达的影响 | 第36-37页 |
| 3.3 转染HSP90AA1特异性shRNA后骨肉瘤细胞中HSP90AA1的表达情况 | 第37-39页 |
| 3.4 抑制HSP90AA1表达后化疗药物对骨肉瘤细胞增殖的影响 | 第39页 |
| 3.5 抑制HSP90AA1表达后化疗药物对骨肉瘤细胞凋亡的影响 | 第39-41页 |
| 3.6 HSP90AA1过表达骨肉瘤细胞系MG-63和U-2OS的建立 | 第41-42页 |
| 3.7 过表达HSP90AA1后化疗药物对骨肉瘤细胞增殖的影响 | 第42-43页 |
| 3.8 过表达HSP90AA1后化疗药物对骨肉瘤细胞凋亡的影响 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-47页 |
| 第二部分 骨肉瘤化疗过程中HSP90AA1对自噬的调节作用 | 第47-64页 |
| 1 材料 | 第47-48页 |
| 1.1 细胞系 | 第47页 |
| 1.2 shRNA | 第47页 |
| 1.3 试剂 | 第47-48页 |
| 1.4 设备和仪器 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-54页 |
| 2.1 细胞培养 | 第48-49页 |
| 2.2 细胞总蛋白提取 | 第49页 |
| 2.3 Westernblot实验 | 第49-51页 |
| 2.4 脂质体介导的shRNA质粒转染 | 第51-52页 |
| 2.5 免疫荧光观察LC3聚合物 | 第52页 |
| 2.6 细胞增殖检测(CCK-8试剂盒) | 第52页 |
| 2.7 细胞凋亡检测(流式细胞仪) | 第52-53页 |
| 2.8 mRFP-GFP-LC3腺病毒感染骨肉瘤细胞 | 第53页 |
| 2.9 透射电镜样品的制备与观察 | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-61页 |
| 3.1 化疗药物作用期间增强HSP90AA1表达对骨肉瘤细胞自噬的影响 | 第54-56页 |
| 3.2 化疗药物作用期间抑制HSP90AA1表达对骨肉瘤细胞自噬的影响 | 第56-58页 |
| 3.3 化疗药物作用期间自噬对骨肉瘤细胞凋亡的调节作用 | 第58-61页 |
| 4 讨论 | 第61-64页 |
| 第三部分 HSP90AA1促进骨肉瘤化疗药物耐药形成的体内实验研究 | 第64-71页 |
| 1 材料 | 第64-65页 |
| 1.1 细胞系 | 第64页 |
| 1.2 实验动物 | 第64页 |
| 1.3 shRNA | 第64页 |
| 1.4 试剂 | 第64-65页 |
| 1.5 设备和仪器 | 第65页 |
| 2 方法 | 第65-68页 |
| 2.1 细胞培养 | 第65-66页 |
| 2.2 脂质体介导的shRNA质粒转染 | 第66页 |
| 2.3 骨肉瘤动物模型的建立(皮下成瘤) | 第66-67页 |
| 2.4 TUNEL检测组织凋亡 | 第67页 |
| 2.5 免疫荧光观察组织LC3 | 第67-68页 |
| 3 结果 | 第68-70页 |
| 3.1 抑制HSP90AA1表达对裸鼠成瘤大小的影响 | 第68页 |
| 3.2 抑制HSP90AA1表达对成瘤组织自噬和凋亡的影响 | 第68-70页 |
| 4 讨论 | 第70-71页 |
| 第四部分 骨肉瘤化疗过程中HSP90AA1促进自噬的机制研究 | 第71-82页 |
| 1 材料 | 第71-72页 |
| 1.1 细胞系 | 第71页 |
| 1.2 shRNA | 第71页 |
| 1.3 试剂 | 第71-72页 |
| 1.4 设备和仪器 | 第72页 |
| 2 方法 | 第72-76页 |
| 2.1 细胞培养 | 第72页 |
| 2.2 细胞总蛋白提取 | 第72-73页 |
| 2.3 Westernblot实验 | 第73-75页 |
| 2.4 脂质体介导的shRNA质粒转染 | 第75页 |
| 2.5 免疫荧光观察LC3聚合物 | 第75-76页 |
| 3 结果 | 第76-79页 |
| 3.1 HSP90AA1调节自噬与PI3K/Akt/mTOR通路的关系 | 第76-79页 |
| 3.2 凋亡的产生与JNK/p38通路的关系 | 第79页 |
| 4 讨论 | 第79-82页 |
| 第五部分 MICRORNA-495靶向调节HSP90AA1对骨肉瘤恶性行为的影响 | 第82-105页 |
| 1 材料 | 第82-84页 |
| 1.1 细胞系 | 第82-83页 |
| 1.2 shRNA | 第83页 |
| 1.3 实验动物 | 第83页 |
| 1.4 试剂 | 第83页 |
| 1.5 设备和仪器 | 第83-84页 |
| 2 方法 | 第84-92页 |
| 2.1 细胞培养 | 第84页 |
| 2.2 细胞总蛋白提取 | 第84页 |
| 2.3 Westernblot实验 | 第84-86页 |
| 2.4 总RNA提取 | 第86-87页 |
| 2.5 HSP90AA1过表达慢病毒感染骨肉瘤细胞 | 第87页 |
| 2.6 miR-495过表达慢病毒感染骨肉瘤细胞 | 第87-88页 |
| 2.7 实时定量PCR | 第88-90页 |
| 2.8 脂质体介导的shRNA、miR-495mimic以及miR-495inhibitor质粒转染 | 第90页 |
| 2.9 荧光素酶报告基因实验 | 第90-91页 |
| 2.10 Transwell细胞迁移实验 | 第91页 |
| 2.11 细胞划痕实验 | 第91页 |
| 2.12 裸鼠肺转移模型的建立、肺组织取材和H&E染色 | 第91-92页 |
| 2.13 统计学分析 | 第92页 |
| 3 结果 | 第92-102页 |
| 3.1 确定靶向调控HSP90AA1的miRNA | 第92-95页 |
| 3.2 miR-495在骨肉瘤侵袭与转移中作用的体内和体外研究 | 第95-100页 |
| 3.3 miR-495通过HSP90AA1抑制骨肉瘤侵袭与转移 | 第100-102页 |
| 4 讨论 | 第102-105页 |
| 小结 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-112页 |
| 个人简历和研究成果 | 第112-114页 |
| 致谢 | 第114页 |
