| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-19页 |
| 1 葡萄糖脱氢酶的种类及产葡萄糖脱氢酶的微生物 | 第9页 |
| 2 源于Bacillus sp.的NAD(P)~+依赖的葡萄糖脱氢酶 | 第9-14页 |
| ·葡萄糖脱氢酶在芽孢杆菌中的作用 | 第10页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的酶学研究 | 第10-11页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的分子生物学研究 | 第11-12页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的结构与功能的关系 | 第12-14页 |
| 3 葡萄糖脱氢酶的应用 | 第14-16页 |
| ·生物燃料电池 | 第14页 |
| ·临床检测 | 第14-15页 |
| ·辅酶再生系统 | 第15-16页 |
| 4 研究策略 | 第16-18页 |
| ·简并PCR | 第16-17页 |
| ·反向PCR | 第17-18页 |
| 5 本研究的目的及内容 | 第18-19页 |
| 第二章 芽孢杆菌Bacillus sp.G3葡萄糖脱氢酶基因的克隆、测序与表达 | 第19-35页 |
| ·材料 | 第19-21页 |
| ·菌种和载体 | 第19页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第19页 |
| ·其它试剂 | 第19页 |
| ·常用培养基和缓冲液 | 第19-20页 |
| ·常用仪器 | 第20-21页 |
| ·实验方法 | 第21-28页 |
| ·Bacillus sp.G3基因组DNA的提取 | 第21页 |
| ·Bacillus sp.G3葡萄糖脱氢酶基因的克隆和测序 | 第21-24页 |
| ·基因克隆策略 | 第21-22页 |
| ·保守区基因序列的PCR扩增 | 第22页 |
| ·侧翼序列的PCR扩增 | 第22-23页 |
| ·PCR产物测序及序列分析 | 第23页 |
| ·扩增葡萄糖脱氢酶基因序列 | 第23-24页 |
| ·重组质粒的构建 | 第24-26页 |
| ·质粒pET-28a(+)的提取 | 第24-25页 |
| ·PCR产物及质粒的酶切 | 第25页 |
| ·酶切产物电泳并割胶回收 | 第25页 |
| ·外源DNA与质粒的连接反应 | 第25-26页 |
| ·克隆载体pMD19-T | 第25-26页 |
| ·表达载体pET-28 a(+) | 第26页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第26页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第26页 |
| ·重组质粒的转化 | 第26页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第26-27页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第27页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第27-28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-34页 |
| ·Bacillus sp.G3 GlcDH基因的扩增 | 第28-31页 |
| ·重组表达载体pET-28a-gdh的构建 | 第31-32页 |
| ·重组表达载体pET-28a-gdh的诱导表达 | 第32-34页 |
| ·结论 | 第34-35页 |
| 第三章 重组葡萄糖脱氢酶的纯化及其性质研究 | 第35-42页 |
| ·材料 | 第35页 |
| ·材料及试剂 | 第35页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第35页 |
| ·主要仪器 | 第35页 |
| ·酶活测定 | 第35-36页 |
| ·方法 | 第36-37页 |
| ·菌体的大量培养 | 第36页 |
| ·重组酶的纯化 | 第36页 |
| ·粗酶液的制备 | 第36页 |
| ·Ni-NTA亲和柱的清洗与平衡 | 第36页 |
| ·Ni-NTA亲和柱分离纯化重组酶 | 第36页 |
| ·重组葡萄糖脱氢酶性质的研究 | 第36-37页 |
| ·酶分子量的测定 | 第36-37页 |
| ·温度和pH对酶活性的影响 | 第37页 |
| ·温度和pH对酶稳定性的影响 | 第37页 |
| ·酶的底物特异性 | 第37页 |
| ·酶促反应动力学研究 | 第37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-41页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的纯化结果 | 第37-38页 |
| ·酶的最适反应温度和最适反应pH | 第38-39页 |
| ·酶的热稳定性和pH稳定性 | 第39-40页 |
| ·酶的底物特异性 | 第40页 |
| ·酶促反应动力学研究 | 第40-41页 |
| ·结论 | 第41-42页 |
| 第四章 结论与展望 | 第42-44页 |
| ·结论 | 第42页 |
| ·论文的创新及意义 | 第42-43页 |
| ·本文工作的不足及展望 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-49页 |
| 致谢 | 第49页 |
