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基于代谢工程改造大肠杆菌生产L-丝氨酸

摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
第一章 文献综述第9-19页
    1.1 L-丝氨酸及其功用第9-10页
        1.1.1 L-丝氨酸第9页
        1.1.2 L-丝氨酸的功能与用途第9-10页
    1.2 L-丝氨酸合成方法第10-11页
        1.2.1 蛋白水解液提取法第10页
        1.2.2 化学合成法第10页
        1.2.3 酶法第10页
        1.2.4 微生物发酵法第10-11页
    1.3 L-丝氨酸的相关代谢过程第11-13页
        1.3.1 L-丝氨酸的合成途径及其调节第11-12页
        1.3.2 L-丝氨酸的分解途径及其调节第12-13页
        1.3.3 L-丝氨酸的转运及其调节第13页
    1.4 微生物发酵法生产 L-丝氨酸研究现状第13-16页
        1.4.1 前体添加发酵法生产 L-丝氨酸第13-14页
        1.4.2 直接发酵法生产 L-丝氨酸第14-16页
    1.5 提高 L-丝氨酸生物合成的代谢工程改造策略第16-17页
    1.6 本课题研究的内容与意义第17-19页
        1.6.1 本课题的研究内容第17页
        1.6.2 本课题研究的意义第17-19页
第二章 实验材料与方法第19-41页
    2.1 实验材料第19-26页
        2.1.1 实验菌种和质粒第19-21页
        2.1.2 主要的实验仪器第21-22页
        2.1.3 实验药品第22-23页
        2.1.4 主要溶液配置第23-26页
        2.1.5 培养基第26页
    2.2 实验方法第26-41页
        2.2.1 菌体的培养与发酵第26-27页
        2.2.2 大肠杆菌及谷氨酸棒状杆菌染色体 DNA 的提取第27-28页
        2.2.3 碱裂解法提取大肠杆菌质粒第28页
        2.2.4 大肠杆菌感受态的制备及转化(CaCl_2法)第28-29页
        2.2.5 大肠杆菌感受态的制备及转化(电转化)第29-30页
        2.2.6 PCR 扩增基因第30-32页
        2.2.7 重组 PCR 反应体系第32页
        2.2.8 菌落(液)PCR第32-33页
        2.2.9 PCR 产物纯化第33-34页
        2.2.10 琼脂糖凝胶电泳第34页
        2.2.11 DNA 片段切胶回收第34-35页
        2.2.12 DNA 的酶切、去磷酸化和连接第35-36页
        2.2.13 目的基因敲除方法第36-39页
        2.2.14 发酵菌体浓度、葡萄糖及发酵产物的测定第39页
        2.2.15 SHMT 酶活的测定第39-40页
        2.2.16 引物的设计和基因测序第40-41页
第三章 实验结果与讨论第41-63页
    3.1 sdaA、sdaB 和 tdcG 基因的敲除第41-47页
        3.1.1 sdaA、sdaB 和 tdcG 基因敲除片段的构建第41-45页
        3.1.2 采用大肠杆菌无痕敲除技术构建敲除工程菌第45-47页
    3.2 L-丝氨酸从头合成途径的过表达第47-49页
        3.2.1 以 p5C 为载体的过表达质粒的构建第47-49页
        3.2.2 电转化得到过表达菌株第49页
    3.3 gcvP 基因的敲除第49-52页
        3.3.1 gcvP 基因敲除相关片段的扩增及构建第50-51页
        3.3.2 采用大肠杆菌无痕敲除技术构建敲除 gcvP 的工程菌第51-52页
    3.4 微调 glyA 基因第52-55页
        3.4.1 设计 glyA 基因的 RBS 文库第52-53页
        3.4.2 置换 glyA 基因自身的 RBS 序列第53-55页
    3.5 工程菌与野生菌的摇瓶发酵表征第55-63页
        3.5.1 sdaA、sdaB 及 tdcG 基因敲除菌生长和积累 L-丝氨酸发酵表征第55-56页
        3.5.2 过表达合成途径对大肠杆菌产 L-丝氨酸的作用第56-58页
        3.5.3 阻断甘氨酸裂解对大肠杆菌生产 L-丝氨酸的作用第58页
        3.5.4 微调 glyA 基因对大肠杆菌产 L-丝氨酸的发酵表征第58-61页
        3.5.5 工程菌的发酵罐发酵试验第61-63页
第四章 结论与展望第63-65页
    4.1 结论第63-64页
    4.2 展望第64-65页
参考文献第65-70页
发表论文和参加科研情况说明第70-71页
致谢第71页

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