| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 第一章 绪论 | 第18-30页 |
| 1.1 DNA甲基化研究进展 | 第18-19页 |
| 1.1.1 DNA甲基化 | 第18页 |
| 1.1.2 DNA甲基化调控转录机制 | 第18-19页 |
| 1.2 DNA甲基化调控酶研究进展 | 第19-21页 |
| 1.2.1 DNA甲基化酶 | 第19-20页 |
| 1.2.2 DNA去甲基化酶 | 第20-21页 |
| 1.3 再生相关信号通路和基因研究概述 | 第21-24页 |
| 1.3.1 Src/PI3K/Akt信号通路 | 第21页 |
| 1.3.2 MAPK/ERK信号通路 | 第21-22页 |
| 1.3.3 JAK/STAT信号通路 | 第22页 |
| 1.3.4 Wnt信号通路 | 第22-23页 |
| 1.3.5 再生相关转录因子 | 第23页 |
| 1.3.6 其他再生相关基因 | 第23-24页 |
| 1.4 棘皮动物再生研究进展 | 第24页 |
| 1.5 海参再生研究进展 | 第24-26页 |
| 1.6 本研究的目的意义与研究思路 | 第26-28页 |
| 1.6.1 目的与意义 | 第26-27页 |
| 1.6.2 科学问题 | 第27页 |
| 1.6.3 研究内容与技术路线 | 第27-28页 |
| 1.6.4 预期成果 | 第28页 |
| 1.7 本章小结 | 第28-30页 |
| 第二章 DNA甲基化调控酶在刺参肠道再生中的调控机制研究 | 第30-64页 |
| 2.1 前言 | 第30-31页 |
| 2.2 材料与方法 | 第31-39页 |
| 2.2.1 样品采集 | 第31-32页 |
| 2.2.2 RNA提取和反转录 | 第32-33页 |
| 2.2.3 刺参DNA甲基化调控酶Dnmt3b、TDG和Tet2过表达载体构建 | 第33-36页 |
| 2.2.4 RNAi片段siRNA制备 | 第36-37页 |
| 2.2.5 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因体内过表达和RNAi | 第37-38页 |
| 2.2.6 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因体外过表达 | 第38页 |
| 2.2.7 CCK8细胞增殖检测 | 第38-39页 |
| 2.2.8 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因序列和系统进化树分析 | 第39页 |
| 2.2.9 数据分析 | 第39页 |
| 2.3 实验结果 | 第39-58页 |
| 2.3.1 DNA甲基化调控酶和甲基结合蛋白在刺参肠道再生过程中的表达特征 | 第39-41页 |
| 2.3.2 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因过表达载体构建 | 第41-42页 |
| 2.3.3 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因序列和系统进化树分析 | 第42-48页 |
| 2.3.4 刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因体外过表达 | 第48-50页 |
| 2.3.5 体外过表达Dnmt3b、TDG和Tet2对细胞增殖相关基因表达的影响 | 第50-51页 |
| 2.3.6 体外过表达刺参Dnmt3b、TDG和Tet2基因对HCT116细胞增殖的影响 | 第51页 |
| 2.3.7 体内过表达Dnmt3b、Tet2和TDG对刺参细胞增殖相关基因表达的影响 | 第51-54页 |
| 2.3.8 体内干扰刺参Dnmt3b、Tet2和TDG基因对刺参增殖相关基因表达的影响 | 第54-58页 |
| 2.4 讨论 | 第58-62页 |
| 2.4.1 DNA甲基化和DNA去甲基化同时参与刺参肠道再生初期的基因调控 | 第58-59页 |
| 2.4.2 刺参DNA甲基化调控酶基因Dnmt3b、Tet2和TDG序列和进化树分析 | 第59-60页 |
| 2.4.3 刺参DNA甲基化调控酶基因Dnmt3b、Tet2和TDG参与调控增殖相关基因的表达 | 第60-62页 |
| 2.5 本章小结 | 第62-64页 |
| 第三章 DNA甲基化对刺参肠道再生的影响 | 第64-84页 |
| 3.1 前言 | 第64-65页 |
| 3.2 材料与方法 | 第65-68页 |
| 3.2.1 样品采集 | 第65-66页 |
| 3.2.2 刺参肠道原代细胞培养 | 第66页 |
| 3.2.3 刺参肠道原代细胞存活率检测 | 第66-67页 |
| 3.2.4 CCK8检测刺参肠道原代细胞增殖 | 第67页 |
| 3.2.5 药物处理后基因检测实验 | 第67页 |
| 3.2.6 刺参肠道原代细胞总RNA提取和RT-qPCR | 第67-68页 |
| 3.2.7 5-氮杂胞苷体内刺激实验 | 第68页 |
| 3.3 实验结果 | 第68-80页 |
| 3.3.1 刺参肠道原代细胞培养 | 第68-75页 |
| 3.3.2 抑制DNA甲基化对吐肠后刺参体内肠道再生的影响 | 第75-77页 |
| 3.3.3 抑制DNA甲基化对吐肠后刺参体内肠道组织基因表达的影响 | 第77-80页 |
| 3.4 讨论 | 第80-82页 |
| 3.4.1 DNA甲基化在刺参肠道再生中的关键作用 | 第80-81页 |
| 3.4.2 抑制DNA甲基化对刺参肠道增殖和DNA甲基化相关基因表达的影响 | 第81-82页 |
| 3.5 本章小结 | 第82-84页 |
| 第四章 刺参肠道再生DNA甲基化图谱构建 | 第84-120页 |
| 4.1 前言 | 第84-85页 |
| 4.2 材料与方法 | 第85-89页 |
| 4.2.1 样品采集 | 第85页 |
| 4.2.2 DNA提取 | 第85页 |
| 4.2.3 全基因组DNA甲基化建库测序流程 | 第85-86页 |
| 4.2.4 序列比对与DNA甲基化水平检测 | 第86页 |
| 4.2.5 差异DNA甲基化区域与DNA甲基化水平差异检测 | 第86页 |
| 4.2.6 GO注释与KEGG富集分析 | 第86-87页 |
| 4.2.7 DNA甲基化基因DNA序列获取 | 第87-88页 |
| 4.2.8 PCR产物纯化测序 | 第88页 |
| 4.2.9 DNA克隆 | 第88页 |
| 4.2.10 硫化处理 | 第88-89页 |
| 4.2.11 BSP-PCR扩增 | 第89页 |
| 4.2.12 BSP-PCR产物纯化和目的片段克隆测序 | 第89页 |
| 4.3 实验结果 | 第89-114页 |
| 4.3.1 DNA质量 | 第89-90页 |
| 4.3.2 全基因组DNA甲基化数据统计分析 | 第90-91页 |
| 4.3.3 全基因组和不同转录元件DNA甲基化水平分析 | 第91-94页 |
| 4.3.4 DMRs相关基因数量统计 | 第94页 |
| 4.3.5 DMRs相关基因的GO和KEGG分析 | 第94-108页 |
| 4.3.6 DMRs相关基因BSP验证 | 第108-114页 |
| 4.4 讨论 | 第114-118页 |
| 4.4.1 刺参肠道再生不同时间的DNA甲基化调控机制不同 | 第114-115页 |
| 4.4.2 神经、免疫和代谢相关通路参与刺参肠道再生受DNA甲基化调控 | 第115-117页 |
| 4.4.3 蛋白修饰、转录因子和粘附分子类基因参与肠道再生受DNA甲基化调控 | 第117-118页 |
| 4.5 本章小结 | 第118-120页 |
| 第五章 刺参肠道再生初级阶段转录组表达谱的构建 | 第120-134页 |
| 5.1 前言 | 第120-121页 |
| 5.2 材料与方法 | 第121-122页 |
| 5.2.1 样品采集 | 第121页 |
| 5.2.2 总RNA提取、cDNA文库构建与测序、序列过滤、比对和质量评估 | 第121页 |
| 5.2.3 基因表达定量分析及差异表达基因(DEG)筛选 | 第121页 |
| 5.2.4 GO功能和KEGG富集分析 | 第121页 |
| 5.2.5 DNA甲基化和转录组联合分析 | 第121页 |
| 5.2.6 Real time PCR | 第121-122页 |
| 5.3 实验结果 | 第122-130页 |
| 5.3.1 测序数据统计分析 | 第122-123页 |
| 5.3.2 RT-qPCR验证 | 第123-124页 |
| 5.3.3 DEGs筛选和热图聚类分析 | 第124页 |
| 5.3.4 DEGs的GO和KEGG富集分析 | 第124-130页 |
| 5.4 讨论 | 第130-132页 |
| 5.5 本章小结 | 第132-134页 |
| 第六章 再生候选基因在刺参肠道再生中的调控机制 | 第134-160页 |
| 6.1 前言 | 第134-136页 |
| 6.2 材料与方法 | 第136-141页 |
| 6.2.1 样品采集和处理 | 第136页 |
| 6.2.2 mRNA和蛋白提取 | 第136页 |
| 6.2.3 RACE克隆 | 第136-137页 |
| 6.2.4 RT-qPCR | 第137-138页 |
| 6.2.5 抗体制备和Western blot | 第138页 |
| 6.2.6 免疫组织化学和TUNEL细胞凋亡检测 | 第138-139页 |
| 6.2.7 过表达载体构建 | 第139-141页 |
| 6.2.8 细胞转染 | 第141页 |
| 6.2.9 细胞增殖检测 | 第141页 |
| 6.2.10 序列聚类分析和数据分析 | 第141页 |
| 6.3 实验结果 | 第141-155页 |
| 6.3.1 DNA甲基化候选基因在刺参肠道再生过程中的表达特征 | 第141-143页 |
| 6.3.2 过表达载体构建 | 第143-144页 |
| 6.3.3 开放阅读框序列克隆和分析 | 第144-146页 |
| 6.3.4 体外过表达DNA甲基化候选基因对增殖相关基因的影响 | 第146-147页 |
| 6.3.5 WntA基因序列和表达特征分析 | 第147-150页 |
| 6.3.6 WntA蛋白表达定位 | 第150-151页 |
| 6.3.7 刺参肠道再生过程中的增殖与凋亡 | 第151-153页 |
| 6.3.8 Wnt家族基因以及信号通路关键基因在刺参肠道再生中的表达特征 | 第153-155页 |
| 6.4 讨论 | 第155-158页 |
| 6.4.1 DNA甲基化候选基因调控刺参肠道再生机制 | 第155-156页 |
| 6.4.2 候选基因WntA在刺参肠道再生中的作用 | 第156-157页 |
| 6.4.3 Wnt信号通路参与刺参肠道再生 | 第157-158页 |
| 6.5 本章小结 | 第158-160页 |
| 第七章 总结与展望 | 第160-162页 |
| 7.1 总结 | 第160页 |
| 7.2 创新性 | 第160页 |
| 7.3 存在问题 | 第160页 |
| 7.4 研究展望 | 第160-162页 |
| 参考文献 | 第162-178页 |
| 致谢 | 第178-182页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第182页 |
