| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 1 绪论 | 第17-33页 |
| ·脂肪酶概述 | 第17-20页 |
| ·脂肪酶定义 | 第17页 |
| ·微生物脂肪酶 | 第17-18页 |
| ·低温微生物脂肪酶 | 第18-20页 |
| ·微生物脂肪酶研究进展 | 第20-23页 |
| ·产脂肪酶微生物的筛选 | 第20页 |
| ·微生物脂肪酶的理化性质 | 第20-21页 |
| ·低温微生物脂肪酶的结构特征 | 第21-22页 |
| ·低温微生物脂肪酶的固定化 | 第22-23页 |
| ·分子生物学在低温脂肪酶中的应用 | 第23-25页 |
| ·低温脂肪酶基因的克隆 | 第23-24页 |
| ·低温脂肪酶基因的表达 | 第24-25页 |
| ·微生物脂肪酶的应用现状与前景 | 第25-30页 |
| ·食品加工方面的应用 | 第26页 |
| ·洗涤剂方面的应用 | 第26-27页 |
| ·环境修复方面的研究 | 第27页 |
| ·生产可降解材料 | 第27页 |
| ·纺织工业的应用 | 第27-28页 |
| ·手性化合物合成中的应用 | 第28页 |
| ·化妆品的应用 | 第28页 |
| ·皮革生产 | 第28页 |
| ·生物柴油制备方面的应用 | 第28-29页 |
| ·纸浆和造纸 | 第29-30页 |
| ·冲绳海槽海洋环境 | 第30页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第30-31页 |
| ·研究内容 | 第31-32页 |
| ·技术路线 | 第32-33页 |
| 2 产低温脂肪酶菌株的筛选与分子鉴定 | 第33-42页 |
| ·实验材料 | 第33-34页 |
| ·样品的采集 | 第33页 |
| ·培养基及试剂 | 第33-34页 |
| ·实验方法 | 第34-36页 |
| ·筛选方法 | 第34页 |
| ·摇瓶培养 | 第34页 |
| ·脂肪酶活力的测定 | 第34-35页 |
| ·对硝基苯酚(p-NP)标准曲线的测定及微摩尔消光系数的测定 | 第35页 |
| ·产脂肪酶菌株的16S rDNA分子鉴定 | 第35-36页 |
| ·脂肪酶活性中心的PCR扩增 | 第36页 |
| ·产脂肪酶菌株生长曲线及酶活曲线测定 | 第36页 |
| ·实验结果 | 第36-40页 |
| ·产低温脂肪酶菌株的筛选 | 第36-37页 |
| ·低温产脂肪酶菌株的16S rDNA分子鉴定及系统发育树的构建 | 第37-38页 |
| ·脂肪酶活性中心的PCR扩增 | 第38-39页 |
| ·对硝基酚标准曲线的测定 | 第39页 |
| ·Psychrobacter sp. C18生长曲线与酶活曲线的测定 | 第39-40页 |
| ·讨论 | 第40-42页 |
| 3 低温脂肪酶基因克隆 | 第42-54页 |
| ·实验材料 | 第43页 |
| ·菌株和质粒 | 第43页 |
| ·工具酶和化学试剂 | 第43页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·染色体DNA文库的构建 | 第43-47页 |
| ·菌株Psychrobacter sp. C18基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·pUC19质粒DNA的提取 | 第44页 |
| ·质粒的去磷酸化 | 第44-46页 |
| ·基因组DNA的酶切 | 第46页 |
| ·CaCl_2法感受态细胞的制备 | 第46页 |
| ·连接反应 | 第46-47页 |
| ·连接产物的转化 | 第47页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第47-48页 |
| ·提取质粒验证插入片段大小 | 第47页 |
| ·阳性克隆子的序列测定 | 第47-48页 |
| ·结果与讨论 | 第48-52页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第48页 |
| ·基因组DNA的酶切 | 第48-49页 |
| ·质粒载体的制备 | 第49-50页 |
| ·基因文库的构建 | 第50页 |
| ·序列测定和分析 | 第50-52页 |
| ·低温脂肪酶基因lipX系统发育树分析 | 第52页 |
| ·讨论 | 第52-54页 |
| 4 低温脂肪酶LipX在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化 | 第54-69页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·限制性内切酶、质粒载体和菌株 | 第54页 |
| ·引物与试剂 | 第54-55页 |
| ·培养基 | 第55页 |
| ·实验方法 | 第55-62页 |
| ·表达载体pET-28a(+)/lipX_(His)的构建 | 第55-59页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第59页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第59页 |
| ·表达条件优化 | 第59-60页 |
| ·脂肪酶活力的测定 | 第60页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第60-61页 |
| ·蛋白分子量的测定 | 第61-62页 |
| ·结果与讨论 | 第62-67页 |
| ·表达载体的构建 | 第62-64页 |
| ·表达条件优化 | 第64-67页 |
| ·蛋白浓度标准曲线的测定 | 第67页 |
| ·小结 | 第67-69页 |
| 5 嗜低温脂肪酶LipX的分离纯化与酶学性质研究 | 第69-81页 |
| ·实验材料 | 第69-70页 |
| ·实验菌株 | 第69页 |
| ·主要试剂 | 第69-70页 |
| ·主要试剂的配制 | 第70页 |
| ·实验方法 | 第70-73页 |
| ·脂肪酶的纯化 | 第70-71页 |
| ·脂肪酶LipX_(His)的酶学性质 | 第71-73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-79页 |
| ·脂肪酶的纯化 | 第73-74页 |
| ·脂肪酶LipX_(His)的酶学性质 | 第74-79页 |
| ·讨论 | 第79-81页 |
| 6 低温脂肪酶LipX的生物信息学分析 | 第81-91页 |
| ·实验材料 | 第81-82页 |
| ·实验菌株 | 第81页 |
| ·生物软件及工具 | 第81-82页 |
| ·结果与讨论 | 第82-90页 |
| ·低温脂肪酶同源序列分析 | 第82-83页 |
| ·信号肽序列的预测 | 第83-84页 |
| ·疏水性分析 | 第84-85页 |
| ·蛋白质一级结构分析 | 第85-86页 |
| ·结构域预测与分析 | 第86页 |
| ·脂肪酶二级结构预测 | 第86-88页 |
| ·蛋白的同源建模 | 第88-90页 |
| ·小结 | 第90-91页 |
| 7 结论与展望 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-98页 |
| 主要实验仪器 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 | 第100-102页 |
| 导师组意见 | 第102页 |
