| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 英文缩写词汇 | 第7-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-21页 |
| 1 DPV概述 | 第16-17页 |
| 1.1 DPV生物学特性 | 第16页 |
| 1.2 DPV基因组特征 | 第16-17页 |
| 1.3 DPV分子生物学研究 | 第17页 |
| 1.4 DPV诊断方法 | 第17页 |
| 2 疱疹病毒UL54基因及其编码蛋白研究进展 | 第17-21页 |
| 2.1 疱疹病毒UL54简介 | 第17页 |
| 2.2 疱疹病毒UL54/ICP27的基本特性 | 第17-18页 |
| 2.3 疱疹病毒ICP27的核质穿梭活性 | 第18页 |
| 2.4 疱疹病毒ICP27的功能 | 第18-20页 |
| 2.4.1 疱疹病ICP27的主要功能区 | 第18-19页 |
| 2.4.2 促进病毒复制 | 第19页 |
| 2.4.3 调控基因表达 | 第19-20页 |
| 2.4.4 影响细胞凋亡 | 第20页 |
| 2.4.5 其他 | 第20页 |
| 2.5 疱疹病毒ICP27活性调节 | 第20-21页 |
| 2.6 展望 | 第21页 |
| 3 选题目的及意义 | 第21页 |
| 第二章 DPV UL54基因生物信息学分析 | 第21-36页 |
| 1 分析内容及方法 | 第21-22页 |
| 1.1 DPV UL54基因ORF搜索 | 第21页 |
| 1.2 密码子分析 | 第21-22页 |
| 1.2.1 DPV UL54密码子偏嗜性分析 | 第21-22页 |
| 1.2.2 稀有密码子分析 | 第22页 |
| 1.3 DPV UL54编码蛋白性质分析 | 第22页 |
| 1.4 DPV UL54编码蛋白抗原表位预测 | 第22页 |
| 1.5 DPV UL54编码蛋白定位预测 | 第22页 |
| 2 分析结果 | 第22-34页 |
| 2.1 DPV UL54基因ORF搜索 | 第22-23页 |
| 2.2 密码子分析 | 第23-28页 |
| 2.2.1 密码子偏嗜性分析 | 第23-28页 |
| 2.2.2 稀有密码子分析 | 第28页 |
| 2.3 DPV UL54编码蛋白性质分析 | 第28-32页 |
| 2.3.1 组成分析 | 第28-29页 |
| 2.3.2 信号肽 | 第29-30页 |
| 2.3.3 跨膜区 | 第30页 |
| 2.3.4 疏水性分析 | 第30-31页 |
| 2.3.5 保守区分析 | 第31页 |
| 2.3.6 氨基酸序列比对 | 第31-32页 |
| 2.3.7 进化树分析 | 第32页 |
| 2.4 DPV UL54编码蛋白抗原表位分析 | 第32-33页 |
| 2.4.1 B细胞抗原表位预测 | 第32-33页 |
| 2.4.2 T细胞抗原表位预测 | 第33页 |
| 2.5 DPV UL54编码蛋白定位预测 | 第33-34页 |
| 2.5.1 DPV UL54蛋白细胞内定位预测 | 第33-34页 |
| 2.5.2 DPV UL54蛋白NES预测 | 第34页 |
| 2.5.3 DPV UL54蛋白NLS预测 | 第34页 |
| 3 讨论 | 第34-36页 |
| 第三章 DPV UL54基因原核表达及多克隆抗体制备 | 第36-50页 |
| 1 试验材料 | 第36-38页 |
| 1.1 毒株、载体、菌株、鸭胚和动物 | 第36-37页 |
| 1.2 主要试剂 | 第37页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第37-38页 |
| 2. 试验方法 | 第38-44页 |
| 2.1 引物设计 | 第38页 |
| 2.2 DPV UL54基因的克隆 | 第38-41页 |
| 2.2.1 制备DEF | 第38页 |
| 2.2.2 DPV接种DEF | 第38页 |
| 2.2.3 DPV-CHv DNA的提取 | 第38-39页 |
| 2.2.4 UL54基因的PCR扩增 | 第39-40页 |
| 2.2.5 重组质粒pMD18-UL54T的构建 | 第40-41页 |
| 2.3 DPV UL54重组蛋白的表达 | 第41-44页 |
| 2.3.1 原核表达质粒pPAL7-UL54构建 | 第41页 |
| 2.3.2 DPV UL54重组蛋白表达 | 第41-43页 |
| 2.3.3 兔抗DPV UL54重组蛋白多克隆抗体制备 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-49页 |
| 3.1 DPV UL54基因克隆 | 第44-45页 |
| 3.2 DPV UL54重组蛋白表达 | 第45-48页 |
| 3.2.1 原核表达重组质粒的鉴定 | 第45-46页 |
| 3.2.2 DPV UL54重组蛋白表达条件优化 | 第46-47页 |
| 3.2.3 DPV UL54重组蛋白纯化 | 第47页 |
| 3.2.4 DPV UL54重组蛋白Western blotting鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3 兔抗DPV UL54蛋白多克隆抗体制备 | 第48-49页 |
| 3.3.1 多抗效价检测 | 第48页 |
| 3.3.2 多抗纯化 | 第48-49页 |
| 3.3.3 多抗特异性检测 | 第49页 |
| 4 讨论 | 第49-50页 |
| 第四章 DPV UL54基本特性研究 | 第50-58页 |
| 1 试验材料 | 第51页 |
| 1.1 毒株、载体、抗体和鸭胚 | 第51页 |
| 1.2 主要试剂 | 第51页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第51页 |
| 2 试验方法 | 第51-54页 |
| 2.1 DPV UL54基因转录时相分析 | 第51-53页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第51页 |
| 2.1.2 实时荧光定量PCR标准曲线制备 | 第51-52页 |
| 2.1.3 DPV UL54基因转录时相分析 | 第52-53页 |
| 2.2 DPV UL54基因类型确定 | 第53页 |
| 2.3 DPV UL54基因表达时相分析 | 第53-54页 |
| 2.3.1 细胞蛋白的提取 | 第53-54页 |
| 2.3.2 蛋白免疫印迹(Western blotting) | 第54页 |
| 2.4 DPV UL54蛋白在DEF细胞中的定位分析 | 第54页 |
| 3 结果 | 第54-57页 |
| 3.1 DPV UL54基因转录时相分析 | 第54-55页 |
| 3.1.1 标准曲线制备 | 第54-55页 |
| 3.1.2 转录时相分析 | 第55页 |
| 3.2 DPV UL54基因类型确定 | 第55-56页 |
| 3.3 DPV UL54表达时相分析 | 第56页 |
| 3.4 DPV UL54蛋白在细胞内的定位分析 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-58页 |
| 第五章 DPV UL54蛋白核质穿梭活性研究 | 第58-85页 |
| 1 试验材料 | 第59-60页 |
| 1.1 细胞和质粒 | 第59-60页 |
| 1.2 主要试剂 | 第60页 |
| 1.3 仪器设备 | 第60页 |
| 2 试验方法 | 第60-65页 |
| 2.1 引物设计 | 第60-61页 |
| 2.2 DPV UL54蛋白核质穿梭活性验证 | 第61-62页 |
| 2.2.1 真核表达质粒pcDNA3.1-UL54的构建 | 第61页 |
| 2.2.2 真核表达质粒pUL54-EGFP的构建 | 第61-62页 |
| 2.2.3 DPV UL54蛋白在转染细胞中的定位 | 第62页 |
| 2.2.4 瞬时种间异核体试验 | 第62页 |
| 2.3 DPV UL54细胞定位信号研究 | 第62-64页 |
| 2.3.1 预测的NES鉴定 | 第62-63页 |
| 2.3.2 预测的NLS鉴定 | 第63-64页 |
| 2.4 DPV UL54蛋白核定位对病毒复制的影响 | 第64-65页 |
| 2.4.1 UL54的NLS缺失突变体(DPV-UL54-mNLSs)的构建 | 第64页 |
| 2.4.2 UL54蛋白核内定位对病毒增殖的影响 | 第64页 |
| 2.4.3 UL54蛋白核内定位对病毒空斑形成大小的影响 | 第64-65页 |
| 2.4.4 UL54蛋白核内定位对病毒基因组DNA复制的影响 | 第65页 |
| 2.4.5 UL54蛋白核内定位对病毒基因表达的影响 | 第65页 |
| 3 结果 | 第65-84页 |
| 3.1 DPV UL54预测的细胞内定位信号分析 | 第65-66页 |
| 3.2 DPV UL54核质穿梭活性研究相关重组质粒构建 | 第66-71页 |
| 3.2.1 重组质粒构建示意图 | 第66页 |
| 3.2.2 重组质粒pCDNA3.1-UL54构建 | 第66-67页 |
| 3.2.3 重组质粒pMD19 simple-UL54T构建 | 第67-68页 |
| 3.2.4 重组质粒pUL54-EGFP构建 | 第68页 |
| 3.2.5 重组质粒pEGFP-mNLS(s)构建 | 第68-70页 |
| 3.2.6 重组质粒pEGFP-mNES构建 | 第70-71页 |
| 3.3 DPV UL54蛋白核质穿梭活性验证 | 第71-72页 |
| 3.4 DPV UL54蛋白的NES研究 | 第72-75页 |
| 3.5 DPV UL54蛋白的NLS研究 | 第75-77页 |
| 3.6 DPV UL54蛋白核定位对病毒复制的影响 | 第77-84页 |
| 3.6.1 DPV-UL54-mNLSs的构建及鉴定 | 第77-80页 |
| 3.6.2 UL54核定位对病毒生长的影响 | 第80页 |
| 3.6.3 UL54核定位对病毒空斑大小的影响 | 第80-81页 |
| 3.6.4 UL54核定位对病毒基因组DNA复制的影响 | 第81页 |
| 3.6.5 UL54核定位对病毒基因mRNA表达的影响 | 第81-84页 |
| 4 讨论 | 第84-85页 |
| 第六章 DPV UL54基因缺失株和回复株的构建 | 第85-98页 |
| 1 试验材料 | 第85-87页 |
| 1.1 菌种和质粒 | 第85-87页 |
| 1.2 主要材料及试剂 | 第87页 |
| 1.3 仪器设备 | 第87页 |
| 2 试验方法 | 第87-91页 |
| 2.1 引物设计 | 第87-88页 |
| 2.2 DPV UL54基因缺失病毒的构建 | 第88-90页 |
| 2.2.1 UL54基因缺失的感染性克隆的构建 | 第88-90页 |
| 2.2.2 重组病毒拯救 | 第90页 |
| 2.2.3 BAC载体的切除 | 第90页 |
| 2.2.4 重组病毒IFA鉴定 | 第90页 |
| 2.2.5 重组病毒Western blotting鉴定 | 第90页 |
| 2.3 重组病毒基本生物学特性 | 第90-91页 |
| 2.3.1 生长曲线 | 第91页 |
| 2.3.2 空斑试验 | 第91页 |
| 2.3.3 病毒基因组DNA拷贝数 | 第91页 |
| 3 结果 | 第91-96页 |
| 3.1 重组病毒感染性克隆鉴定 | 第91-92页 |
| 3.2 重组病毒拯救及BAC-EGFP标签去除 | 第92-93页 |
| 3.3 IFA鉴定 | 第93页 |
| 3.4 Western blotting鉴定 | 第93页 |
| 3.5 生长曲线 | 第93-94页 |
| 3.6 空斑试验 | 第94-95页 |
| 3.7 病毒基因组DNA拷贝数 | 第95-96页 |
| 3.7.1 实时荧光定量PCR检测DPV标准曲线制备 | 第95页 |
| 3.7.2 样品检测 | 第95-96页 |
| 4 讨论 | 第96-98页 |
| 第七章 DPV UL54调控病毒基因表达的研究 | 第98-113页 |
| 1 试验材料 | 第98-99页 |
| 1.1 毒株 | 第98页 |
| 1.2 主要试剂及配置 | 第98-99页 |
| 1.3 仪器设备 | 第99页 |
| 2 试验方法 | 第99-101页 |
| 2.1 引物设计 | 第99页 |
| 2.2 病毒的接种及收样 | 第99页 |
| 2.3 DPV UL54对病毒基因mRNA表达的调控 | 第99-100页 |
| 2.3.1 β-actin、UL19、UL30、UL48、gC、gD和gK基因标准曲线制备 | 第99页 |
| 2.3.2 样品检测 | 第99-100页 |
| 2.4 DPV UL54对病毒基因转录的调控 | 第100页 |
| 2.4.1 核runoff试验 | 第100页 |
| 2.4.2 定量检测 | 第100页 |
| 2.5 DPV UL54对UL30 mRNA核输出的调控 | 第100页 |
| 2.5.1 探针设计 | 第100页 |
| 2.5.2 荧光原位杂交试验 | 第100页 |
| 2.6 DPV UL54对病毒基因翻译的调控 | 第100-101页 |
| 2.6.1 RNC的提取 | 第100-101页 |
| 2.6.2 定量检测 | 第101页 |
| 3 结果 | 第101-112页 |
| 3.1 β-actin、UL19、UL30、UL48、gC、gD、gK标准曲线制备 | 第101-104页 |
| 3.2 DPV UL54调控病毒基因mRNA的表达 | 第104-106页 |
| 3.3 DPV UL54调控病毒基因的转录 | 第106-108页 |
| 3.4 DPV UL54促进UL30 mRNA的核输出 | 第108-109页 |
| 3.5 DPV UL54调控病毒基因的翻译 | 第109-112页 |
| 4 讨论 | 第112-113页 |
| 第八章 DPV UL54对DEF细胞凋亡的影响 | 第113-123页 |
| 1 试验材料 | 第114页 |
| 1.1 毒株及质粒 | 第114页 |
| 1.2 主要试剂及配置 | 第114页 |
| 1.3 仪器设备 | 第114页 |
| 2 试验方法 | 第114-115页 |
| 2.1 样品处理 | 第114页 |
| 2.2 形态学检测 | 第114-115页 |
| 2.2.1 DAPI染色 | 第114页 |
| 2.2.2 HE染色 | 第114-115页 |
| 2.3 Annexin V/PI双染流式检测 | 第115页 |
| 2.4 定量检测Caspase-3的表达 | 第115页 |
| 2.4.1 标准曲线制备 | 第115页 |
| 2.4.2 定量检测 | 第115页 |
| 2.5 Caspase-3活性检测 | 第115页 |
| 3 结果 | 第115-121页 |
| 3.1 DAPI染核 | 第115-116页 |
| 3.2 HE染色 | 第116-117页 |
| 3.3 流式细胞仪检测 | 第117-118页 |
| 3.4 Caspase-3表达量检测 | 第118-120页 |
| 3.4.1 标准曲线制备 | 第118-119页 |
| 3.4.2 定量检测 | 第119-120页 |
| 3.5 Caspase-3活性检测 | 第120-121页 |
| 4 讨论 | 第121-123页 |
| 全文总结 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-135页 |
| 致谢 | 第135-136页 |
| 攻读学位期间以第一作者身份发表的学术论文 | 第136页 |
