| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 英文缩写字母表 | 第9-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-21页 |
| 1 胰岛素样生长因子的简介 | 第14-15页 |
| 1.1 胰岛素样生长因子的发现 | 第14页 |
| 1.2 胰岛素样生长因子IGF-1的结构与特点 | 第14-15页 |
| 2 IGF-1的表达调控 | 第15-16页 |
| 2.1 营养对IGF-1的表达调控 | 第15-16页 |
| 2.2 激素对IGF-1的调控 | 第16页 |
| 3 IGF-1的生物学功能 | 第16-19页 |
| 3.1 IGF-1对动物生长性能的影响 | 第16-18页 |
| 3.2 IGF-1对动物免疫细胞的调节作用 | 第18-19页 |
| 4 pIGF-1在养猪业上的应用 | 第19页 |
| 5 本项目研究的目的与意义 | 第19-21页 |
| 第二章 藏猪IGF-1基因的克隆及生物信息学分析 | 第21-34页 |
| 1 试验材料 | 第21-23页 |
| 1.1 猪肝脏 | 第21页 |
| 1.2 质粒与菌株 | 第21页 |
| 1.3 酶和试剂 | 第21页 |
| 1.4 PCR引物设计与合成 | 第21-22页 |
| 1.5 仪器 | 第22页 |
| 1.6 试剂及培养基的配制 | 第22-23页 |
| 2 试验方法 | 第23-25页 |
| 2.1 藏猪IGF-1全长序列的扩增 | 第23页 |
| 2.1.1 藏猪总RNA的提取 | 第23页 |
| 2.1.2 RT-PCR | 第23页 |
| 2.2 pMD19-T-IGF-1质粒的构建与序列测定分析 | 第23-24页 |
| 2.2.1 IGF-1全长序列的纯化回收 | 第23页 |
| 2.2.2 目的片段与克隆载体的连接及转化子的鉴定 | 第23-24页 |
| 2.2.3 IGF-1全长序列的测序鉴定 | 第24页 |
| 2.3 IGF-1全长序列的生物信息学分析 | 第24-25页 |
| 2.3.1 生物信息学分析相关网址 | 第24-25页 |
| 3 试验结果 | 第25-32页 |
| 3.1 藏猪肝脏组织总RNA的提取 | 第25页 |
| 3.2 目的基因的扩增 | 第25-26页 |
| 3.3 IGF-1基因多重序列比较分析 | 第26页 |
| 3.4 IGF-1全长序列比对分析及进化树的构建 | 第26-27页 |
| 3.5 藏猪IGF-1基因编码氨基酸的生物信息学分析 | 第27-32页 |
| 3.5.1 藏猪IGF-1基因编码氨基酸理化性质的分析 | 第27-28页 |
| 3.5.2 IGF-1信号肽分析 | 第28-29页 |
| 3.5.3 IGF-1的疏水性预测 | 第29-30页 |
| 3.5.4 IGF-1跨膜结构分析 | 第30页 |
| 3.5.5 IGF-1磷酸化位点分析 | 第30页 |
| 3.5.6 藏猪IGF-1氨基酸的初级结构和空间结构 | 第30-32页 |
| 4 讨论 | 第32-34页 |
| 第三章 藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达 | 第34-50页 |
| 1 试验材料 | 第34-36页 |
| 1.1 质粒及菌株 | 第34页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第34页 |
| 1.3 试剂及培养基的配制 | 第34-35页 |
| 1.4 PCR引物设计与合成 | 第35-36页 |
| 2 试验方法 | 第36-40页 |
| 2.1 藏猪IGF-1成熟肽基因扩增及重组表达载体pET-32a-IGF-1的构建 | 第36-37页 |
| 2.1.1 藏猪IGF-1成熟肽基因的扩增 | 第36页 |
| 2.1.2 重组表达载体pET-32a-IGF-1的构建 | 第36页 |
| 2.1.3 重组表达载体pET-32a-IGF-1的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2 融合蛋白的诱导表达与鉴定 | 第37-39页 |
| 2.2.1 pET-32a-IGF-1转化宿主菌E.coli.BL21 | 第37页 |
| 2.2.2 IGF-1融合蛋白的初步诱导表达 | 第37-38页 |
| 2.2.3 诱导剂IPTG浓度的优化 | 第38页 |
| 2.2.4 目标蛋白在大肠杆菌中的定位分析 | 第38页 |
| 2.2.5 目标蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.6 表达产物的Western blot鉴定 | 第39页 |
| 2.3 蛋白含量的测定 | 第39-40页 |
| 2.4 重组表达产物的活性分析 | 第40页 |
| 3 试验结果 | 第40-47页 |
| 3.1 藏猪IGF-1成熟肽基因的扩增 | 第40-41页 |
| 3.2 重组表达载体pET32a-IGF-1构建与鉴定 | 第41-42页 |
| 3.3 重组融合蛋白的初步诱导表达 | 第42页 |
| 3.4 诱导融合蛋白表达IPTG浓度的优化 | 第42-43页 |
| 3.5 不同诱导时间的优化 | 第43-44页 |
| 3.6 不同诱导温度的优化 | 第44页 |
| 3.7 pET32a-IGF-1融合蛋白表达的可溶性分析 | 第44-45页 |
| 3.8 IGF-1融合蛋白纯化 | 第45-46页 |
| 3.9 IGF-1表达产物Western Blot鉴定 | 第46页 |
| 3.10 IGF-1蛋白含量的测定 | 第46-47页 |
| 3.11 重组表达产物的活性分析 | 第47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 4.1 大肠杆菌表达系统 | 第47-48页 |
| 4.2 大肠杆菌诱导表达条件的优化 | 第48-49页 |
| 4.3 IGF-1蛋白的分离纯化 | 第49页 |
| 5 结论 | 第49-50页 |
| 第四章 藏猪IGF-1成熟肽真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达 | 第50-66页 |
| 1 试验材料 | 第50-52页 |
| 1.1 菌种与质粒 | 第50页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第50页 |
| 1.3 引物的设计与合成 | 第50-51页 |
| 1.4 仪器 | 第51页 |
| 1.5 试剂及培养基的配制 | 第51-52页 |
| 2 试验方法 | 第52-56页 |
| 2.1 IGF-1成熟肽基因的扩增及克隆载体的构建与鉴定 | 第52页 |
| 2.2 重组表达载体pPIC9K-IGF-1的构建与鉴定 | 第52-53页 |
| 2.2.1 目的基因和pPIC9K的EcoRI和NotI双酶切和连接转化 | 第52-53页 |
| 2.2.2 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态 | 第53页 |
| 2.2.3 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第53页 |
| 2.3 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第53-54页 |
| 2.3.1 GS115菌株的分离纯化 | 第53页 |
| 2.3.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第53-54页 |
| 2.3.3 重组表达载体pPIC9K-IGF-1的线性转化 | 第54页 |
| 2.4 阳性毕赤酵母菌株的筛选 | 第54页 |
| 2.4.1 选择培养基鉴定重组酵母表型 | 第54页 |
| 2.4.2 重组菌株表型的PCR检测 | 第54页 |
| 2.5 高拷贝转化子的筛选 | 第54页 |
| 2.6 重组酵母的诱导表达 | 第54-55页 |
| 2.7 融合蛋白的分离纯化 | 第55-56页 |
| 2.8 目标蛋白的Dot Blot检测 | 第56页 |
| 2.9 BCA法测定蛋白浓度 | 第56页 |
| 2.10 重组表达产物生物活性的测定 | 第56页 |
| 3 结果 | 第56-62页 |
| 3.1 藏猪成熟肽IGF-1基因的扩增和克隆载体的构建 | 第56-57页 |
| 3.2 重组表达载体pPIC9K-IGF-1的鉴定及其线性化 | 第57-58页 |
| 3.3 重组表达载体pPIC9K-IGF-1的线性化 | 第58-59页 |
| 3.4 重组酵母表型MM和MD平板的筛选 | 第59页 |
| 3.5 重组酵母表型的PCR鉴定 | 第59-60页 |
| 3.6 高拷贝转化子的筛选 | 第60页 |
| 3.7 重组酵母的诱导表达 | 第60页 |
| 3.8 纯化产物的Tris-Tricine-SDS-PAGE检测 | 第60-61页 |
| 3.9 IGF-1蛋白含量的测定 | 第61页 |
| 3.10 重组酵母表达上清和纯化蛋白的Dot-Blot检测 | 第61页 |
| 3.11 重组表达产物的功能分析 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-65页 |
| 4.1 毕赤酵母表达系统 | 第62页 |
| 4.2 毕赤酵母的电击转化 | 第62-63页 |
| 4.3 毕赤酵母的诱导表达 | 第63页 |
| 4.4 酵母表达上清的处理与检测 | 第63-64页 |
| 4.5 酵母表达与原核表达相比较 | 第64-65页 |
| 5 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附录 测序结果 | 第73-75页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第75页 |
