| 中文摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-25页 |
| 1.1 单增李斯特菌的概述 | 第13-16页 |
| 1.1.1 单增李斯特菌的生物学特征 | 第13页 |
| 1.1.2 单增李斯特菌的血清型分类 | 第13-14页 |
| 1.1.3 单增李斯特菌的危害及流行情况 | 第14页 |
| 1.1.4 单增李斯特菌的致病机理 | 第14-16页 |
| 1.1.4.1 溶血素 | 第15页 |
| 1.1.4.2 内化素 | 第15页 |
| 1.1.4.3 肌动蛋白聚集蛋白 | 第15-16页 |
| 1.1.4.4 细胞壁水解酶 | 第16页 |
| 1.2 单增李斯特菌检测方法的研究进展 | 第16-23页 |
| 1.2.1 传统分离鉴定法 | 第16-17页 |
| 1.2.2 分子生物学检测法 | 第17-19页 |
| 1.2.2.1 PCR检测技术 | 第17-18页 |
| 1.2.2.2 多重PCR技术 | 第18页 |
| 1.2.2.3 实时荧光定量PCR技术 | 第18-19页 |
| 1.2.2.4 等温扩增技术 | 第19页 |
| 1.2.2.5 基因芯片技术 | 第19页 |
| 1.2.3 免疫学检测法 | 第19-22页 |
| 1.2.3.1 酶联免疫吸附法 | 第20页 |
| 1.2.3.2 免疫层析法 | 第20-21页 |
| 1.2.3.3 免疫磁分离法 | 第21-22页 |
| 1.2.4 生物传感器检测法 | 第22-23页 |
| 1.2.4.1 免疫传感器 | 第22-23页 |
| 1.2.4.2 适配体传感器 | 第23页 |
| 1.3 研究目的及意义 | 第23-24页 |
| 1.4 研究内容 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-42页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-28页 |
| 2.1.1 菌株 | 第25页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第25页 |
| 2.1.3 载体与菌株 | 第25页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.5 培养基和溶液 | 第26-27页 |
| 2.1.6 实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-42页 |
| 2.2.1 p60蛋白的原核表达 | 第28-29页 |
| 2.2.1.1 单增李斯特菌的培养 | 第28页 |
| 2.2.1.2 构建p60蛋白表达载体 | 第28页 |
| 2.2.1.3 转化及鉴定 | 第28页 |
| 2.2.1.4 p60蛋白的诱导表达、分离纯化及鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.2 李斯特菌多克隆抗体的制备 | 第29-31页 |
| 2.2.2.1 动物免疫 | 第29页 |
| 2.2.2.2 兔血清效价检测 | 第29-30页 |
| 2.2.2.3 抗李斯特菌血清的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.4 血清的纯化 | 第30页 |
| 2.2.2.5 多抗对李斯特菌属反应性检测 | 第30-31页 |
| 2.2.2.6 多抗对其它菌株交叉反应分析 | 第31页 |
| 2.2.3 免疫磁珠与多重PCR联用检测食品中的单增李斯特菌 | 第31-34页 |
| 2.2.3.1 免疫磁珠的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.3.2 免疫磁珠吸附菌体 | 第32页 |
| 2.2.3.3 捕获菌株DNA模板的提取 | 第32页 |
| 2.2.3.4 双重PCR检测引物合成及特异性验证 | 第32-33页 |
| 2.2.3.5 双重PCR扩增条件的优化 | 第33-34页 |
| 2.2.3.6 免疫磁珠双重PCR检测单增李斯特菌的灵敏度测定 | 第34页 |
| 2.2.4 实际样品检测 | 第34页 |
| 2.2.4.1 样品采集与人工染菌 | 第34页 |
| 2.2.4.2 人工染菌样品检测及重复性验证 | 第34页 |
| 2.2.5 单增李斯特菌单链抗体的制备 | 第34-42页 |
| 2.2.5.1 小鼠免疫 | 第34页 |
| 2.2.5.2 鼠血清效价检测 | 第34-35页 |
| 2.2.5.3 噬菌体抗体库的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.5.4 噬菌体抗体库的淘选 | 第37-39页 |
| 2.2.5.5 Phage-ELISA对淘选结果进行筛选 | 第39-40页 |
| 2.2.5.6 单链抗体的表达 | 第40页 |
| 2.2.5.7 单链抗体的生物素化与纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.5.8 单链抗体特异性分析 | 第41页 |
| 2.2.5.9 基于单链抗体的间接ELISA检测单增李斯特菌灵敏度测定 | 第41-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-55页 |
| 3.1 单增李斯特菌p60蛋白的原核表达 | 第42-44页 |
| 3.1.1 单增李斯特菌p60蛋白表达载体的构建 | 第42页 |
| 3.1.2 单增李斯特菌p60蛋白表达菌的构建 | 第42-43页 |
| 3.1.3 p60蛋白的诱导表达及可溶性分析 | 第43-44页 |
| 3.1.4 重组蛋白序列测定 | 第44页 |
| 3.2 李斯特菌多克隆抗体的制备 | 第44-46页 |
| 3.2.1 兔血清效价检测 | 第44页 |
| 3.2.2 血清纯化结果 | 第44-45页 |
| 3.2.3 多抗交叉反应检测结果 | 第45-46页 |
| 3.3 免疫磁珠与双重PCR联用检测食品中的单增李斯特菌 | 第46-50页 |
| 3.3.1 免疫磁珠用量的优化 | 第46-47页 |
| 3.3.2 免疫磁珠孵育时间的优化 | 第47页 |
| 3.3.3 双重PCR特异性检测结果 | 第47-48页 |
| 3.3.4 双重PCR模板用量的优化 | 第48页 |
| 3.3.5 双重PCR引物用量的优化 | 第48-49页 |
| 3.3.6 免疫磁珠双重PCR检测单增李斯特菌方法的灵敏度 | 第49-50页 |
| 3.3.7 人工染菌实验 | 第50页 |
| 3.4 单增李斯特菌单链抗体的制备 | 第50-55页 |
| 3.4.1 小鼠血清效价检测 | 第50-51页 |
| 3.4.2 噬菌体抗体库的构建 | 第51-52页 |
| 3.4.3 噬菌体抗体库的淘选 | 第52页 |
| 3.4.4 单链抗体的筛选 | 第52-53页 |
| 3.4.5 P2噬菌体单链抗体的表达、生物素化与纯化 | 第53-54页 |
| 3.4.6 单链抗体特异性分析 | 第54页 |
| 3.4.7 基于P2单链抗体的ELISA方法的灵敏度测定 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| 4.1 单增李斯特菌抗体的制备 | 第55-56页 |
| 4.2 免疫磁珠多重PCR检测方法的建立 | 第56-57页 |
| 5 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第64页 |
