| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-20页 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统 | 第11-12页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展 | 第11页 |
| 1.1.2 毕赤酵母表达系统的优缺点 | 第11-12页 |
| 1.2 毕赤酵母AOX1启动子与甲醇代谢途径 | 第12-14页 |
| 1.2.1 毕赤酵母AOX1启动子 | 第12-13页 |
| 1.2.2 甲醇代谢途径 | 第13-14页 |
| 1.2.3 转录调控因子 | 第14页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统其他启动子的开发 | 第14-18页 |
| 1.3.1 DAS和FLD1启动子 | 第15页 |
| 1.3.2 GAP、TEF1和GCW14、PGK1启动子 | 第15-17页 |
| 1.3.3 PEX8和YPT1启动子 | 第17页 |
| 1.3.4 P_(G1)和P_(G6)启动子 | 第17-18页 |
| 1.3.5 毕赤酵母中启动子的来源 | 第18页 |
| 1.4 转录组学及RNA-seq技术 | 第18页 |
| 1.5 本课题研究的目的及意义 | 第18-20页 |
| 第2章 P_(AOX1)转录调控和过氧化物酶体形成相关基因的筛选 | 第20-31页 |
| 2.1 前言 | 第20页 |
| 2.2 实验材料 | 第20-21页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第20页 |
| 2.2.2 培养基及培养条件 | 第20-21页 |
| 2.2.3 主要分子生物学试剂 | 第21页 |
| 2.3 实验方法 | 第21-24页 |
| 2.3.1 引物设计及PCR反应程序 | 第21页 |
| 2.3.2 大肠杆菌感受态的制备与转化 | 第21-23页 |
| 2.3.3 大肠杆菌质粒抽提 | 第23页 |
| 2.3.4 毕赤酵母感受态的制备及电穿孔转化 | 第23页 |
| 2.3.5 毕赤酵母基因组的提取 | 第23-24页 |
| 2.3.6 转座子标签突变技术 | 第24页 |
| 2.3.7 热不对称交错PCR技术 | 第24页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第24-29页 |
| 2.4.1 转座子突变质粒PMSBHis4MazfARS的构建 | 第24-25页 |
| 2.4.2 缺失株GS115-△FLD1、GS115-△MXR1△FLD1、GS1115-APRM1△FLD1的构建 | 第25-26页 |
| 2.4.3 验证GS1115-△FLD1缺失株在甲醇中的生长表型 | 第26-27页 |
| 2.4.4 筛选所用甲醇浓度的确定 | 第27-29页 |
| 2.4.6 利用转座子标签技术构建突变库 | 第29页 |
| 2.4.7 利用突变库筛选相关基因 | 第29页 |
| 2.5 小结 | 第29-31页 |
| 第3章 毕赤酵母中可用于异源表达的启动子筛选与鉴定 | 第31-49页 |
| 3.1 前言 | 第31页 |
| 3.2 实验材料与实验方法 | 第31-37页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第31页 |
| 3.2.2 培养基和主要生物学试剂 | 第31-32页 |
| 3.2.3 引物设计 | 第32页 |
| 3.2.4 GFP荧光蛋白表达菌株的构建 | 第32-34页 |
| 3.2.5 GFP的酶标仪测定 | 第34页 |
| 3.2.6 总RNA的抽提 | 第34-35页 |
| 3.2.7 反转录PCR制备cDNA | 第35页 |
| 3.2.8 新启动子的GFP荧光菌株转录水平的测定 | 第35页 |
| 3.2.9 淀粉酶表达菌株的构建 | 第35页 |
| 3.2.10 DNS试剂测定还原糖含量 | 第35-36页 |
| 3.2.11 淀粉酶的酶活力测定 | 第36-37页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第37-48页 |
| 3.3.1 根据RNA-seq数据和RNA折叠自由能筛选有潜力的启动子 | 第37页 |
| 3.3.2 启动子表达GFP报告基因水平分析 | 第37-43页 |
| 3.3.3 启动子表达重组高温淀粉酶的能力分析 | 第43-48页 |
| 3.4 本章小结 | 第48-49页 |
| 第4章 5L生物反应器中新型启动子表达强度的鉴定与分析 | 第49-55页 |
| 4.1 前言 | 第49页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第49-50页 |
| 4.2.1 实验菌株与质粒 | 第49页 |
| 4.2.2 培养基和培养条件 | 第49页 |
| 4.2.3 L生物反应器发酵 | 第49-50页 |
| 4.2.4 淀粉酶的酶活测定 | 第50页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第50-53页 |
| 4.3.1 GS115-P_(0472)-AmyA菌株的发酵 | 第50-52页 |
| 4.3.2 GS115-P_(0547)-AmyA菌株的发酵 | 第52页 |
| 4.3.3 P_(AOX1)与P_(0547)的转录调控 | 第52-53页 |
| 4.4 本章小结 | 第53-55页 |
| 第5章 总结、创新点与展望 | 第55-57页 |
| 5.1 总结 | 第55页 |
| 5.2 创新点 | 第55页 |
| 5.3 展望 | 第55-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 攻读硕士期间研究成果 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
