| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 一、前言 | 第9-16页 |
| 1. 疟疾及疟原虫简介 | 第9-10页 |
| 2. 非编码RNA研究简介 | 第10-13页 |
| 3. 粘附调节机制 | 第13-15页 |
| 4. 本课题前期工作 | 第15-16页 |
| 二、实验材料 | 第16-27页 |
| 1. 化学试剂及实验材料 | 第16页 |
| 2. 工具酶、分子量标准及试剂盒 | 第16-17页 |
| 3. 培养基 | 第17页 |
| 4. 恶性疟原虫 | 第17页 |
| 5. 探针及引物合成 | 第17-23页 |
| 6. 质粒载体 | 第23-25页 |
| 7. 菌株和细胞株 | 第25页 |
| 8. 本实验所用主要仪器 | 第25-26页 |
| 9. 分析软件 | 第26-27页 |
| 三、实验方法 | 第27-60页 |
| 1. 红内期恶性疟原虫体外培养、冻存与复苏 | 第27-29页 |
| 1.1 P.falciparum 3D7的体外培养 | 第27-28页 |
| 1.2 细胞冻存 | 第28页 |
| 1.3 细胞复苏 | 第28页 |
| 1.4 细胞计数 | 第28-29页 |
| 2. 红内期恶性疟原虫3D7的同步化与虫体提取 | 第29页 |
| 2.1 恶性疟原虫环期同步化培养 | 第29页 |
| 2.2 裂解感染红细胞、收集虫体 | 第29页 |
| 3. 总RNA的提取与鉴定 | 第29-39页 |
| 3.1 总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 3.2 小片段RNA的提取 | 第30-31页 |
| 3.3 RNA样品的凝胶电泳 | 第31-32页 |
| 3.4 体外转录合成DIG标记的RNA探针 | 第32-37页 |
| 3.5 RNA印记实验(Northern blot) | 第37-39页 |
| 4. RUF6-15过表达载体的构建、转染与鉴定 | 第39-46页 |
| 4.1 RUF6-15过表达载体的构建 | 第39-42页 |
| 4.2 质粒转染 | 第42-44页 |
| 4.3 抗性虫株的相关鉴定 | 第44-45页 |
| 4.4 生长曲线的制作 | 第45页 |
| 4.5 粘附实验 | 第45-46页 |
| 5. 对照株与过表达株转录水平的高通量测序、分析及鉴定 | 第46-49页 |
| 5.1 建库测序 | 第46-48页 |
| 5.2 生物信息分析流程 | 第48页 |
| 5.3 高通量结果的鉴定 | 第48-49页 |
| 6. RUF6-15 Knockdown虫株的建立 | 第49页 |
| 6.1 RUF6-15的Antisense的合成 | 第49页 |
| 6.2 Antisense转染 | 第49页 |
| 7. FISH(fluorescence in situ hybridization) | 第49-51页 |
| 7.1 相关试剂的配制 | 第49-50页 |
| 7.2 实验步骤 | 第50-51页 |
| 8. 荧光素酶实验 | 第51-54页 |
| 8.1 预测RUF6-15分别与靶基因的结合位点 | 第51页 |
| 8.2 重组表达荧光素酶的pcDNA3.1-Luc质粒 | 第51-52页 |
| 8.3 293ET细胞的转染 | 第52-53页 |
| 8.4 荧光素酶实验(Dual-Luciferase Reporter Assay) | 第53-54页 |
| 9. 流式检测转染效率 | 第54页 |
| 10. Biotin pulldown实验 | 第54-60页 |
| 10.1 T7/SP6体外转录 | 第54-55页 |
| 10.2 Biotin Pull-down | 第55-56页 |
| 10.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品 | 第56-58页 |
| 10.4 银染 | 第58-60页 |
| 四、实验结果 | 第60-83页 |
| 本研究基本思路 | 第60-61页 |
| 1. RUF6-15在红内期恶性疟原虫3D7中的表达特性 | 第61-63页 |
| 1.1 RNA探针的体外转录 | 第61页 |
| 1.2 不同时间点RUF6-15的转录特性 | 第61-62页 |
| 1.3 RUF6-15在恶性疟原虫3D7中的定位 | 第62-63页 |
| 2. RUF6-15过表达株的建立及鉴定 | 第63-66页 |
| 2.1 RUF6-15过表达株的建立 | 第63-64页 |
| 2.2 RUF6-15过表达株的鉴定 | 第64-66页 |
| 3. 转录本水平的高通量测序及验证 | 第66-77页 |
| 3.1 RNA-Seq | 第66-68页 |
| 3.2 数据分析 | 第68-75页 |
| 3.3 差异基因的验证 | 第75-77页 |
| 4. RUF6-15敲低株的建立及相关基因鉴定 | 第77-81页 |
| 4.1 RUF6-15敲低株的建立 | 第77-79页 |
| 4.2 RUF6-15敲低株的鉴定 | 第79-80页 |
| 4.3 RUF6-15敲低株相关靶基因的检测 | 第80-81页 |
| 5. RUF6-15与靶基因的作用关系 | 第81-83页 |
| 五、讨论 | 第83-86页 |
| 六、小结 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-91页 |
| 文献综述：CRISPR系统介导的基因组编辑在恶性疟原虫研究中的应用 | 第91-96页 |
| 参考文献 | 第94-96页 |
| 附录Ⅰ：NH141103_pfa_ref转录组生物信息分析结题报告 | 第96-142页 |
| 附录Ⅱ：博士期间发表的文章和参加的会议 | 第142-143页 |
| 致谢 | 第143-144页 |
