| 第一部分 抗VEGF与IL-10主动免疫对HPV感染肿瘤模型的作用 | 第8-57页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-16页 |
| 1.1 肿瘤微环境 | 第11页 |
| 1.2 IL-I0功能及其在肿瘤免疫抑制微环境中的作用 | 第11-12页 |
| 1.3 VEGF功能及其在肿瘤免疫抑制微环境中的作用 | 第12-14页 |
| 1.4 本课题研究思路、目的及意义 | 第14-16页 |
| 1.4.1 研究思路 | 第14页 |
| 1.4.2 研究目的 | 第14-15页 |
| 1.4.3 研究意义 | 第15-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-17页 |
| 2.1.1 实验质粒、菌株、细胞株 | 第16页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第16页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第16-17页 |
| 2.1.3.1 酶及抗体 | 第16页 |
| 2.1.3.2 试剂盒 | 第16-17页 |
| 2.1.3.3 主要试剂及耗材 | 第17页 |
| 2.2 主要仪器设备 | 第17页 |
| 2.3 实验方法 | 第17-18页 |
| 2.3.1 IL-10及VEGF抗原肽的分析确定与合成制备 | 第17页 |
| 2.3.2 引物的合成 | 第17-18页 |
| 2.3.3 IL-10全基因合成 | 第18页 |
| 2.4 构建重组表达质粒HBcAg-KKK、HBcAg-VEGF | 第18-23页 |
| 2.4.1 退火复性 | 第18-19页 |
| 2.4.2 酶切反应 | 第19页 |
| 2.4.3 酶切产物回收 | 第19-20页 |
| 2.4.4 连接反应 | 第20页 |
| 2.4.5 感受态制备 | 第20-21页 |
| 2.4.6 转化实验 | 第21页 |
| 2.4.7 质粒提取 | 第21-22页 |
| 2.4.8 酶切鉴定 | 第22-23页 |
| 2.5 构建表达重组硫氧还蛋白融合蛋白Trx-IL10的质粒 | 第23-24页 |
| 2.5.1 酶切反应 | 第23页 |
| 2.5.2 酶切产物回收 | 第23页 |
| 2.5.3 连接反应 | 第23-24页 |
| 2.5.4 转化实验与质粒提取 | 第24页 |
| 2.5.5 酶切鉴定 | 第24页 |
| 2.6 重组质粒的诱导表达及可溶性鉴定 | 第24-25页 |
| 2.7 病毒样颗粒的纯化 | 第25-26页 |
| 2.7.1 硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白 | 第25-26页 |
| 2.7.2 蔗糖密度梯度离心再次纯化重组蛋白 | 第26页 |
| 2.8 病毒样颗粒的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.8.1 透视电子显微镜观察 | 第26页 |
| 2.8.2 高效液相色谱(HPLC)分析 | 第26-27页 |
| 2.9 蛋白浓度测定 | 第27页 |
| 2.10 Trx-IL10样品的表达及纯化 | 第27-28页 |
| 2.11 Western检测目的蛋白 | 第28-29页 |
| 2.12 抗原肽与病毒样颗粒的化学偶联 | 第29页 |
| 2.13 TC-1肿瘤细胞培养 | 第29-30页 |
| 2.14 小鼠预防性免疫实验 | 第30页 |
| 2.15 小鼠移植肿瘤模型的建立 | 第30页 |
| 2.16 预防性实验效果评价 | 第30-34页 |
| 2.16.1 小鼠肿瘤体积测量 | 第30页 |
| 2.16.2 小鼠全血血清制备 | 第30页 |
| 2.16.3 ELISA检测细胞因子的表达 | 第30-31页 |
| 2.16.4 ELISPOT检测分泌IFN-γ的T细胞的水平 | 第31-32页 |
| 2.16.5 流式细胞术检测TH2细胞分泌水平 | 第32-33页 |
| 2.16.6 石蜡切片 | 第33-34页 |
| 第三章 实验结果 | 第34-51页 |
| 3.1 酶切鉴定重组质粒 | 第34页 |
| 3.2 重组蛋白进行诱导表达并鉴定可溶性 | 第34-36页 |
| 3.3 蛋白纯化 | 第36-38页 |
| 3.3.1 硫酸铵盐析法纯化重组蛋白 | 第36-37页 |
| 3.3.2 蔗糖密度梯度离心进一步纯化目的蛋白 | 第37-38页 |
| 3.4 病毒样颗粒的鉴定 | 第38-40页 |
| 3.4.1 HPLC分析病毒样颗粒的存在与纯度 | 第38-39页 |
| 3.4.2 透视电子显微镜观察病毒样颗粒 | 第39-40页 |
| 3.5 重组蛋白Trx-IL10进行western Blot鉴定与Q阴离子柱纯化 | 第40-42页 |
| 3.5.1 Western Blot鉴定重组蛋白Trx-IL10 | 第40-41页 |
| 3.5.2 重组蛋白Trx-IL10进行Q-Sepharose FF阴离子柱纯化 | 第41-42页 |
| 3.6 抗原肽与病毒样颗粒载体的化学偶联 | 第42-43页 |
| 3.7 疫苗免疫对TC-1移植小鼠肿瘤生长的干预 | 第43-51页 |
| 3.7.1 疫苗免疫后特异抗体水平检测 | 第43-44页 |
| 3.7.2 疫苗预防性免疫对小鼠肿瘤生长的影响 | 第44-45页 |
| 3.7.3 肿瘤抗原特异细胞免疫应答 | 第45-46页 |
| 3.7.4 血清中细胞因子表达水平 | 第46-47页 |
| 3.7.5 应用流式细胞术检测细胞中Th2细胞增殖情况 | 第47-49页 |
| 3.7.6 肿瘤组织石蜡切片经H&E染色观察肿瘤血管生成 | 第49-51页 |
| 第四章 讨论 | 第51-55页 |
| 4.1 靶向VEGF和IL-10的病毒样颗粒疫苗的构建 | 第51-52页 |
| 4.2 靶向VEGF和IL-10的疫苗免疫的效果评价 | 第52-53页 |
| 4.3 疫苗免疫抗肿瘤生长的效应机制评价 | 第53-54页 |
| 4.4 小鼠肿瘤病理切片评价 | 第54-55页 |
| 第五章 结论与展望 | 第55-57页 |
| 5.1 结论 | 第55页 |
| 5.2 展望 | 第55-57页 |
| 第二部分 碳、氮源对酵母高密度发酵及不同启动子指导的HPV16 L1表达的影响 | 第57-82页 |
| 摘要 | 第57-58页 |
| Abstract | 第58-60页 |
| 第一章 前言 | 第60-65页 |
| 1.1 HPV及其引起的疾病 | 第60页 |
| 1.2 HPV相关疫苗的研究和发展 | 第60-61页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第61-62页 |
| 1.4 毕赤酵母启动子研究进展 | 第62页 |
| 1.5 本课题研究思路、目的及意义 | 第62-65页 |
| 1.5.1 研究思路 | 第62-63页 |
| 1.5.2 研究目的 | 第63页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第63-65页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第65-68页 |
| 2.1 实验材料 | 第65页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第65页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第65页 |
| 2.2 主要仪器 | 第65页 |
| 2.3 常用试剂配制 | 第65页 |
| 2.4 实验方法 | 第65-68页 |
| 2.4.1 种子液制备 | 第65页 |
| 2.4.2 小型发酵罐(1.5L)的高密度发酵 | 第65-66页 |
| 2.4.3 OD_(600)的检测 | 第66页 |
| 2.4.4 湿重检测 | 第66页 |
| 2.4.5 Western blot检测HPV 16L1蛋白的表达 | 第66页 |
| 2.4.6 软件分析蛋白表达水平及表达产量 | 第66页 |
| 2.4.7 HPV16L1蛋白初步纯化 | 第66-68页 |
| 2.4.7.1 溶液配制 | 第66-67页 |
| 2.4.7.2 初步纯化 | 第67页 |
| 2.4.7.3 电镜观察 | 第67-68页 |
| 第三章 实验结果 | 第68-77页 |
| 3.1 具P_(TEF)/HPV16 L1表达单元的毕赤酵母利用不同碳源生长增殖情况 | 第68页 |
| 3.2 不同碳源利用条件下P_(TEF)指导的HPV16_L1蛋白表达率动态分析 | 第68-70页 |
| 3.3 不同碳源利用条件下P_(TEF)指导的HPV16_L1蛋白总产量动态分析 | 第70-71页 |
| 3.4 具P_(FLD)/HPV16 L1表达单元的毕赤酵母利用不同碳氮源的生长增殖情况 | 第71页 |
| 3.5 不同碳氮源组合下P_(FLD)指导的HPV16_L1蛋白表达率动态分析 | 第71-73页 |
| 3.6 不同碳氮源组合下P_(FLD)指导的HPV16_L1蛋白总产量动态分析 | 第73-74页 |
| 3.7 具P_(AOX1)/HPV16 L1表达单元的毕赤酵母菌体生长增殖情况 | 第74页 |
| 3.8 Western blot分析甲醇诱导毕赤酵母P_(AOX1)指导的HPV16_L1的表达 | 第74-75页 |
| 3.9 毕赤酵母在P_(AOX1)指导下利用甲醇诱导的HPV16_L1蛋白的纯化 | 第75-77页 |
| 第四章 讨论 | 第77-80页 |
| 4.1 启动子P_(TEF)指导下的HPV16L1蛋白表达 | 第77-78页 |
| 4.2 启动子P_(FLD)指导下的HPV16L1蛋白表达 | 第78页 |
| 4.3 启动子P_(AOX1)指导下的HPV16L1蛋白的表达与纯化 | 第78-79页 |
| 4.4 小结 | 第79-80页 |
| 第五章 结论与展望 | 第80-82页 |
| 5.1 结论 | 第80页 |
| 5.2 展望 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-85页 |
| 附录 | 第85-93页 |
| 附录Ⅰ 英文缩写词 | 第85-86页 |
| 附录Ⅱ 主要溶液的配制 | 第86-90页 |
| 附录Ⅲ 主要试剂及耗材 | 第90-91页 |
| 附录Ⅳ 主要仪器 | 第91-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 作者简介 | 第95-96页 |
