| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 引言 | 第12-17页 |
| 0.1 DHCR24蛋白的发现 | 第12-13页 |
| 0.2 DHCR24及其保护作用 | 第13-14页 |
| 0.3 DHCR24与P53和MDM2之间的相互作用 | 第14页 |
| 0.4 DHCR24拓扑结构,调整机制以及甲基化方面的研究 | 第14-15页 |
| 0.5 蛋白互作筛选技术 | 第15页 |
| 0.6 研究的目的意义 | 第15-17页 |
| 第1章 重组质粒PT7CFE1-His-DHCR24的构建 | 第17-27页 |
| 1.1 引言 | 第17-18页 |
| 1.2 实验材料 | 第18-19页 |
| 1.2.1 生化试剂耗材 | 第18页 |
| 1.2.2 主要仪器设备 | 第18-19页 |
| 1.2.3 试剂的配制 | 第19页 |
| 1.3 实验方法 | 第19-24页 |
| 1.3.1 pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis质粒的转化、扩增 | 第19-22页 |
| 1.3.1.1 质粒转化 | 第19-20页 |
| 1.3.1.2 质粒小量提取 | 第20-21页 |
| 1.3.1.3 质粒酶切验证 | 第21页 |
| 1.3.1.4 质粒中提扩增 | 第21-22页 |
| 1.3.2 片段回收 | 第22-23页 |
| 1.3.3 酶连重组 | 第23-24页 |
| 1.3.4 重组质粒的酶切验证和序列测定 | 第24页 |
| 1.4 实验结果与讨论 | 第24-25页 |
| 1.5 结论 | 第25-27页 |
| 第2章 1-Step Human Coupled IVT Kit实现DHCR24体外表达及功能验证 | 第27-36页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-28页 |
| 2.2.1 生化试剂及耗材 | 第27-28页 |
| 2.2.2 试剂的配制 | 第28页 |
| 2.3 实验方法 | 第28-33页 |
| 2.3.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表达DHCR24 | 第28-29页 |
| 2.3.2 Western Blot检测DHCR24蛋白的表达 | 第29页 |
| 2.3.3 免疫共沉淀验证表达DHCR24功能 | 第29-33页 |
| 2.3.3.1 N2A细胞复苏传代、冻存 | 第30-31页 |
| 2.3.3.2 DHCR24与MDM2的免疫共沉淀 | 第31-32页 |
| 2.3.2.2 Western Blot检测DHCR24与MDM2相互作用 | 第32-33页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第33-35页 |
| 2.4.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表达DHCR24的验证 | 第33-34页 |
| 2.4.2 Western Blot检测DHCR24和MDM2蛋白的相互作用 | 第34-35页 |
| 2.5 结论 | 第35-36页 |
| 第3章 免疫共沉淀联合质谱分析技术筛选DHCR24互作蛋白 | 第36-55页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.2.1 生化试剂及耗材 | 第36-37页 |
| 3.2.2 试剂的配制 | 第37页 |
| 3.3 实验方法 | 第37-43页 |
| 3.3.1 Ad293细胞复苏、传代及总蛋白的提取 | 第37-39页 |
| 3.3.1.1 Ad293细胞复苏 | 第37-38页 |
| 3.3.1.2 Ad293细胞传代 | 第38页 |
| 3.3.1.3 Ad293细胞冻存 | 第38页 |
| 3.3.1.4 Ad293细胞总蛋白的提取 | 第38-39页 |
| 3.3.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表达DHCR24 | 第39-41页 |
| 3.3.2.1 高效表达DHCR24蛋白 | 第39-40页 |
| 3.3.2.2 BCA法测定表达DHCR24蛋白的浓度 | 第40页 |
| 3.3.2.3 免疫共沉淀法沉淀DHCR24相互作用蛋白 | 第40-41页 |
| 3.3.3 蛋白质谱法检测DHCR24相互作用蛋白 | 第41-43页 |
| 3.3.3.1 免疫共沉淀样本的考马斯亮蓝染色 | 第41-42页 |
| 3.3.3.2 免疫共沉淀胶点蛋白的蛋白质谱 | 第42页 |
| 3.3.3.3 免疫共沉淀样本全蛋白的蛋白质谱 | 第42-43页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第43-54页 |
| 3.4.1 免疫共沉淀样本考马斯染色分析 | 第43页 |
| 3.4.2 免疫共沉淀特异条带质谱分析 | 第43-44页 |
| 3.4.3 免疫共沉淀全蛋白质谱鉴定差异分析 | 第44-54页 |
| 3.5 结论 | 第54-55页 |
| 第4章 噬菌体展示技术筛选DHCR24相互作用蛋白 | 第55-66页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.1.1 噬菌体展示技术 | 第55页 |
| 4.1.2 蓝白斑筛选 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-62页 |
| 4.3.1 大肠杆菌BLT5403的扩增和保存 | 第56-57页 |
| 4.3.1.1 大肠杆菌BLT5403的复苏 | 第56-57页 |
| 4.3.1.3 大肠杆菌BLT5403的保存 | 第57页 |
| 4.3.2 T7噬菌体的扩增和保存 | 第57页 |
| 4.3.3 噬菌体的滴度测定 | 第57-58页 |
| 4.3.3.1 T7原始噬菌体滴度测定 | 第57-58页 |
| 4.3.3.2 扩增后的T7噬菌体滴度测定 | 第58页 |
| 4.3.4 噬菌体展示技术可行性实验 | 第58-59页 |
| 4.3.5 阳性对照实验 | 第59-60页 |
| 4.3.6 DHCR24蛋白的包被和生物淘洗 | 第60-61页 |
| 4.3.6.1 DHCR24蛋白的包被 | 第60页 |
| 4.3.6.2 生物淘洗 | 第60-61页 |
| 4.3.7 噬菌体筛选的PCR | 第61页 |
| 4.3.8 噬菌体筛选片段的TA克隆 | 第61-62页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第62-65页 |
| 4.4.1 人脑cDNA文库T7噬菌体的初始浓度测定结果 | 第62页 |
| 4.4.2 人脑cDNA文库T7噬菌体的扩增后的浓度测定结果 | 第62页 |
| 4.4.3 噬菌体展示技术可行性实验结果 | 第62-63页 |
| 4.4.4 噬菌体展示阳性对照实验结果 | 第63页 |
| 4.4.5 生物淘洗过程中的噬菌体滴度测定结果 | 第63-64页 |
| 4.4.6 噬菌体筛选的PCR | 第64-65页 |
| 4.5 结论 | 第65-66页 |
| 第5章 结果与展望 | 第66-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-71页 |
| 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况 | 第71页 |
