| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-13页 |
| 引言 | 第13-25页 |
| 1 布鲁氏菌病的概况 | 第13页 |
| 2 布鲁氏菌免疫学的研究概况 | 第13-15页 |
| ·先天性免疫 | 第14页 |
| ·补体(complement) | 第14页 |
| ·天然杀伤性细胞(NK cell) | 第14页 |
| ·巨噬细胞(macrophages) | 第14页 |
| ·获得性免疫 | 第14-15页 |
| ·相关细胞因子的作用 | 第15页 |
| ·自然抗性相关巨噬细胞蛋白1(NRAMP1) | 第15页 |
| 3 布鲁氏菌疫苗的研究进展 | 第15-24页 |
| ·传统疫苗的研究概况 | 第15-16页 |
| ·经典的马耳他布鲁氏菌REV-1 弱毒疫苗 | 第15页 |
| ·粗糙型的流产布鲁氏菌活毒株R851 疫苗 | 第15-16页 |
| ·活的弱毒B.abortus 519 株疫苗 | 第16页 |
| ·猪布鲁氏菌52 菌苗 | 第16页 |
| ·羊布鲁氏菌5 号菌苗(M5) | 第16页 |
| ·DNA 疫苗的研究进展 | 第16-24页 |
| ·佐剂的研究 | 第16-19页 |
| ·相关布鲁氏菌保护性抗原的研究进展 | 第19-23页 |
| ·反向疫苗学为新疫苗的研发提供新思路 | 第23-24页 |
| 4 展望 | 第24页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第24-25页 |
| 试验研究 | 第25-75页 |
| 第一部分 布鲁氏菌未知功能分子的克隆、原核表达及鉴定 | 第25-50页 |
| 1 材料 | 第25-27页 |
| ·菌株、质粒及细胞 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器 | 第25-26页 |
| ·常用溶液的配制 | 第26-27页 |
| 2 实验方法 | 第27-35页 |
| ·生物信息学分析 | 第27页 |
| ·PCR 引物设计 | 第27页 |
| ·布鲁氏菌16M 的培养及基因组的提取 | 第27-29页 |
| ·布鲁氏菌DNA 序列的扩增 | 第29-30页 |
| ·目的基因片段的鉴定和纯化回收 | 第30-31页 |
| ·电泳 | 第30页 |
| ·回收试剂盒回收扩增的DNA 片段 | 第30-31页 |
| ·PCR 产物与 T 载体连接 | 第31页 |
| ·新鲜感受态细胞的制备(CaCL2法) | 第31页 |
| ·连接产物的转化 | 第31-32页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第32页 |
| ·重组质粒的小量提取 | 第32页 |
| ·重组原核表达载体的构建 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白的表达及纯化 | 第33-35页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第33-34页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第34页 |
| ·重组蛋白的脱盐 | 第34页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第34-35页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第35页 |
| ·Western blot 鉴定目的蛋白 | 第35页 |
| 3 实验结果 | 第35-49页 |
| ·生物学分析结果 | 第35-38页 |
| ·布鲁氏菌16M 基因组序列分析 | 第35-36页 |
| ·3D 结构 | 第36-38页 |
| ·布鲁氏菌18 个蛋白基因的扩增及酶切鉴定 | 第38-41页 |
| ·布鲁氏菌重组蛋白的原核表达、纯化及Western blot 鉴定结果 | 第41-49页 |
| ·布鲁氏菌重组蛋白的原核表达 | 第41-47页 |
| ·布鲁氏菌重组蛋白的纯化及鉴定 | 第47-48页 |
| ·布鲁氏菌重组蛋白的Western blot 鉴定结果 | 第48-49页 |
| 4 小结与讨论 | 第49-50页 |
| 第二部分 布鲁氏菌未知功能分子的克隆、真核表达及鉴定 | 第50-61页 |
| 1 材料 | 第50-51页 |
| ·菌株、质粒及细胞 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·主要仪器 | 第50页 |
| ·常用溶液的配制 | 第50-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-54页 |
| ·PCR 引物设计 | 第51页 |
| ·布鲁氏菌DNA 序列的扩增 | 第51页 |
| ·重组真核表达载体的构建 | 第51页 |
| ·真核重组质粒转染MDCK 细胞进行瞬时表达 | 第51-53页 |
| ·真核重组质粒转染MDCK 细胞后的免疫细胞化学鉴定 | 第53-54页 |
| ·重组真核质粒的大量提取 | 第54页 |
| 3 实验结果 | 第54-60页 |
| ·布鲁氏菌18 个蛋白基因的扩增及酶切鉴定 | 第54-58页 |
| ·免疫细胞化学鉴定18 个蛋白基因在MDCK 细胞中的表达 | 第58-60页 |
| 4 小结和讨论 | 第60-61页 |
| 第三部分 新型疫苗免疫原性的初步研究 | 第61-75页 |
| 1 材料 | 第61页 |
| ·重组质粒、纯化蛋白及菌株 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| 2 实验方法 | 第61-64页 |
| ·DNA 疫苗免疫动物 | 第61-62页 |
| ·重组蛋白疫苗免疫动物 | 第62页 |
| ·重组蛋白疫苗的制备 | 第62页 |
| ·重组蛋白免疫动物 | 第62页 |
| ·DNA 疫苗与重组蛋白疫苗共同免疫动物 | 第62页 |
| ·ELISA 法检测免疫小鼠血清抗体效价 | 第62-63页 |
| ·脾脏淋巴细胞的制备 | 第63页 |
| ·ELISPOT 法检测特异性 IFN-γ和 IL-4 分泌细胞 | 第63-64页 |
| ·脾脏T 淋巴细胞亚群分析 | 第64页 |
| ·统计学方法 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-74页 |
| ·间接ELISA 法确定抗原和抗体最佳工作浓度 | 第64-65页 |
| ·ELISA 法检测免疫小鼠血清 IgG 的抗体效价 | 第65-67页 |
| ·以M5 裂解蛋白为包被抗原比较不同剂量组血清IgG 抗体效价 | 第65-67页 |
| ·以纯化后蛋白为包被抗原比较不同剂量组血清IgG 抗体效价 | 第67页 |
| ·抗体亚型分类 | 第67-69页 |
| ·以M5 裂解蛋白为抗原的抗体亚型分类结果 | 第67-69页 |
| ·纯化后蛋白包被的抗体亚型分类结果 | 第69页 |
| ·特异性IFN-γ和IL-4 分泌型细胞的检测 | 第69-72页 |
| ·特异性刺激抗原浓度的确定 | 第69-70页 |
| ·不同组别特异性IFN-γ和IL-4 分泌细胞数量的比较 | 第70-72页 |
| ·淋巴细胞亚群分析 | 第72-74页 |
| 4 小结与讨论 | 第74-75页 |
| 全文讨论 | 第75-79页 |
| 1 布鲁氏菌外膜蛋白的预测 | 第75-76页 |
| 2 布鲁氏菌未知功能分子的克隆、表达及鉴定 | 第76页 |
| 3 免疫效果评价 | 第76-79页 |
| ·体液免疫效果评价 | 第76-77页 |
| ·细胞免疫效果评价 | 第77-79页 |
| 结论 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-86页 |
| 附录 | 第86-88页 |
| 作者简介 | 第88页 |
