| 摘要 | 第15-17页 |
| Abstract | 第17-19页 |
| 1 前言 | 第20-39页 |
| 1.1 烟草花叶病毒(TMV)研究概况 | 第20-26页 |
| 1.1.1 TMV粒体及基因组结构与功能 | 第20-24页 |
| 1.1.1.1 TMV基因组及其编码的126kD、183kD和54kD蛋白 | 第21-23页 |
| 1.1.1.2 TMV Ⅰ_2 sgRNA及其编码的MP | 第23页 |
| 1.1.1.3 TMV-CP sgRNA及其编码的CP | 第23-24页 |
| 1.1.2 TMV的侵染生物学 | 第24-26页 |
| 1.1.2.1 TMV的侵染和复制 | 第24-26页 |
| 1.1.2.2 TMV病毒粒体的自我组装 | 第26页 |
| 1.2 黄瓜花叶病毒(CMV)研究概况 | 第26-28页 |
| 1.2.1 CMV的分类 | 第26-27页 |
| 1.2.2 CMV粒体及基因组结构特点 | 第27页 |
| 1.2.3 CMV各基因组及亚基因组的特点及所编码的蛋白 | 第27-28页 |
| 1.2.4 CMV的侵染循环 | 第28页 |
| 1.3 抗TMV植物源小分子活性成分的研究概况 | 第28-30页 |
| 1.3.1 生物碱类物质 | 第29页 |
| 1.3.2 黄酮类物质 | 第29-30页 |
| 1.3.3 精油类物质 | 第30页 |
| 1.3.4 其他小分子活性物质 | 第30页 |
| 1.4 鸦胆子主要成分 | 第30-31页 |
| 1.4.1 苦木苦味素类化合物(Quassinoids) | 第30-31页 |
| 1.4.2 酸类成分 | 第31页 |
| 1.4.3 生物碱 | 第31页 |
| 1.4.4 酚性成分 | 第31页 |
| 1.5 Quassinoids及其生物活性 | 第31-33页 |
| 1.5.1 抗病毒活性 | 第31-32页 |
| 1.5.2 抗肿瘤活性 | 第32页 |
| 1.5.3 抗疟活性 | 第32页 |
| 1.5.4 其他生物活性 | 第32-33页 |
| 1.6 三萜类化合物的生物活性研究 | 第33-34页 |
| 1.7 抗病毒活性成分抗烟草花叶病毒作用机理研究概况 | 第34-36页 |
| 1.7.1 抑制病毒侵染 | 第34-35页 |
| 1.7.1.1 与病毒粒子结合影响侵染位点的建立 | 第34页 |
| 1.7.1.2 破坏病毒粒子的完整性 | 第34-35页 |
| 1.7.1.3 在寄主表面形成保护层 | 第35页 |
| 1.7.2 抑制病毒增殖 | 第35页 |
| 1.7.2.1 阻止病毒核酸与寄主核糖体结合 | 第35页 |
| 1.7.2.2 影响病毒相关蛋白和核酸的合成以及病毒的装配 | 第35页 |
| 1.7.3 诱导寄主抗病性 | 第35-36页 |
| 1.7.4 作用于传毒介体 | 第36页 |
| 1.8 本研究的目的、意义及技术路线 | 第36-39页 |
| 2 鸦胆子活性成分的分离鉴定、抗病毒活性测定及构效关系分析 | 第39-83页 |
| 2.1 材料和方法 | 第39-46页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 2.1.1.1 实验仪器 | 第39-40页 |
| 2.1.1.2 药品及溶剂 | 第40页 |
| 2.1.1.3 供试寄主、供试毒源及抗体 | 第40页 |
| 2.1.2 试验方法 | 第40-46页 |
| 2.1.2.1 TMV的分离纯化 | 第40-41页 |
| 2.1.2.2 提纯病毒的电镜观察及浓度计算 | 第41页 |
| 2.1.2.3 TMV抗血清的制备 | 第41-42页 |
| 2.1.2.4 TMV抗血清效价测定 | 第42页 |
| 2.1.2.5 抗体适宜工作浓度测定 | 第42页 |
| 2.1.2.6 化合物抗病毒侵染活性测定 | 第42-43页 |
| 2.1.2.7 化合物抗病毒增殖活性测定 | 第43页 |
| 2.1.2.8 化合物抗TMV抑制中浓度(EC_(50))的计算 | 第43页 |
| 2.1.2.9 鸦胆子活性成分的提取分离及结构鉴定 | 第43-46页 |
| 2.2 实验结果 | 第46-81页 |
| 2.2.1 提纯病毒的电镜观察 | 第46页 |
| 2.2.2 提纯病毒的浓度 | 第46页 |
| 2.2.3 抗血清的效价 | 第46-47页 |
| 2.2.4 抗体的适宜工作浓度 | 第47页 |
| 2.2.5 TMV浓度曲线 | 第47-48页 |
| 2.2.6 鸦胆子中quassinoids的结构鉴定 | 第48-60页 |
| 2.2.6.1 化合物1 | 第48页 |
| 2.2.6.2 化合物2 | 第48-49页 |
| 2.2.6.3 化合物3 | 第49页 |
| 2.2.6.4 化合物4 | 第49-50页 |
| 2.2.6.5 化合物5 | 第50-60页 |
| 2.2.7 臭椿中三种quassinoids结构 | 第60-68页 |
| 2.2.7.1 化合物6 | 第60-61页 |
| 2.2.7.2 化合物7 | 第61页 |
| 2.2.7.3 化合物8 | 第61-68页 |
| 2.2.8 其他化合物 | 第68-78页 |
| 2.2.9 Quassinoids抗TMV活性及抑制中浓度 | 第78页 |
| 2.2.10 化合物1—8抗CMV和PVY侵染活性 | 第78-79页 |
| 2.2.11 Quassinoids抗植物病毒SAR分析 | 第79-81页 |
| 2.2.12 化合物9—17抗TMV活性 | 第81页 |
| 2.3 讨论 | 第81-83页 |
| 3 TMV-MP的表达及特异性抗体制备 | 第83-98页 |
| 3.1 材料和方法 | 第83-92页 |
| 3.1.1 TMV病毒及试剂 | 第83页 |
| 3.1.2 主要实验仪器 | 第83-84页 |
| 3.1.3 试验动物 | 第84页 |
| 3.1.4 菌株和质粒 | 第84-85页 |
| 3.1.5 PCR引物合成 | 第85页 |
| 3.1.6 病叶总RNA提取及RT-PCR反应 | 第85-87页 |
| 3.1.6.1 病叶总RNA的提取 | 第85-86页 |
| 3.1.6.2 cDNA合成 | 第86页 |
| 3.1.6.3 PCR扩增 | 第86-87页 |
| 3.1.6.4 PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳及回收 | 第87页 |
| 3.1.7 大肠杆菌克隆载体的构建 | 第87-89页 |
| 3.1.7.1 PCR扩增产物与pMD18-T克隆载体的连接 | 第87-88页 |
| 3.1.7.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第88页 |
| 3.1.7.3 连接产物或重组质粒转化 | 第88页 |
| 3.1.7.4 质粒提取 | 第88页 |
| 3.1.7.5 重组克隆质粒的双酶切鉴定 | 第88-89页 |
| 3.1.7.6 重组克隆质粒的PCR鉴定 | 第89页 |
| 3.1.8 原核表达载体的构建 | 第89页 |
| 3.1.9 序列测定与分析 | 第89页 |
| 3.1.10 融合蛋白的表达 | 第89-90页 |
| 3.1.11 表达产物的可溶性分析 | 第90-91页 |
| 3.1.12 融合蛋白抗血清的制备 | 第91页 |
| 3.1.13 抗血清效价及被感染烟草叶片内的TMV-MP检测 | 第91-92页 |
| 3.2 结果与分析 | 第92-95页 |
| 3.2.1 TMV-MP基因的PCR扩增结果 | 第92页 |
| 3.2.2 TMV-MP基因克隆载体的酶切鉴定 | 第92-93页 |
| 3.2.3 TMV-MP表达载体的构建 | 第93-94页 |
| 3.2.4 TMV-MP融合蛋白的表达 | 第94页 |
| 3.2.4.1 融合蛋白的分子量预测 | 第94页 |
| 3.2.4.2 融合蛋白的诱导表达 | 第94页 |
| 3.2.4.3 融合蛋白的可溶性分析 | 第94页 |
| 3.2.5 抗血清的制备及效价测定 | 第94-95页 |
| 3.2.6 抗血清效价及被感染烟草叶片内的TMV-MP检测 | 第95页 |
| 3.3 讨论 | 第95-98页 |
| 4 Quassinoids体外抗TMV侵染机理 | 第98-108页 |
| 4.1 材料与方法 | 第98-100页 |
| 4.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物 | 第98页 |
| 4.1.2 Quassinoids对TMV粒子的直接作用 | 第98页 |
| 4.1.3 透析处理对quassinoids化合物抗TMV活性的影响 | 第98-99页 |
| 4.1.4 TMV粒体与quassinoids结合的紫外检测 | 第99页 |
| 4.1.5 TMV外壳蛋白的提纯 | 第99页 |
| 4.1.6 对TMV-CP体外聚合作用的影响 | 第99页 |
| 4.1.7 TMV-RNA的制备及检测 | 第99-100页 |
| 4.1.8 Quassinoids对TMV-RNA的作用 | 第100页 |
| 4.2 结果 | 第100-106页 |
| 4.2.1 Quassinoids对TMV粒体结构的影响 | 第100-101页 |
| 4.2.2 透析处理后两种提取物的抗病毒作用 | 第101-102页 |
| 4.2.3 Quassinoids与TMV结合情况的紫外扫描 | 第102-103页 |
| 4.2.4 Quassinoids对TMV-CP体外聚合作用的影响 | 第103-104页 |
| 4.2.5 Quassinoids对TMV-RNA的作用 | 第104-106页 |
| 4.3 讨论 | 第106-108页 |
| 5 Bruceine D抗TMV增殖机理 | 第108-139页 |
| 5.1 材料与方法 | 第108-114页 |
| 5.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物 | 第108页 |
| 5.1.2 供试仪器和试剂 | 第108-109页 |
| 5.1.3 Bruceine D对TMV核酸复制影响的real time-PCR检测 | 第109-111页 |
| 5.1.3.1 BruceineD对TMV基因组及亚基因组复制的影响 | 第109页 |
| 5.1.3.2 引物的合成 | 第109页 |
| 5.1.3.3 RNA的反转录及PCR反应 | 第109-110页 |
| 5.1.3.4 目的基因及内参基因标准曲线的建立 | 第110-111页 |
| 5.1.3.5 处理及未处理样品中目的基因的相对定量 | 第111页 |
| 5.1.3.6 Bruceine D处理后不同时间段对TMV基因组复制的影响 | 第111页 |
| 5.1.3.7 Bruceine D对TMV基因组RNA在寄主体内移动的影响 | 第111页 |
| 5.1.4 半定量PCR检测Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响 | 第111-112页 |
| 5.1.4.1 处理及检测 | 第111-112页 |
| 5.1.4.2 半定量RT-PCR引物合成 | 第112页 |
| 5.1.4.3 半定量RT-PCR条件的优化 | 第112页 |
| 5.1.5 Bruceine D对TMV-CP合成的影响 | 第112页 |
| 5.1.6 Bruceine D对TMV在寄主植株中移动及症状表现的影响 | 第112-113页 |
| 5.1.7 Bruceine D对接种后不同时间段TMV-CP表达情况的影响 | 第113页 |
| 5.1.8 接种病毒不同时间后Bruceine D对TMV-CP的抑制作用 | 第113页 |
| 5.1.9 Bruceine D对TMV-MP合成的影响 | 第113页 |
| 5.1.10 BruceineD在细胞水平对TMV增殖的影响 | 第113-114页 |
| 5.1.10.1 普通烟K_(326)愈伤组织的制备 | 第113页 |
| 5.1.10.2 悬浮细胞的制备 | 第113-114页 |
| 5.1.10.3 TMV接种烟草悬浮细胞 | 第114页 |
| 5.2 结果与分析 | 第114-134页 |
| 5.2.1 Bruceine D处理48 h对TMV基因组及亚基因组复制的影响 | 第114-123页 |
| 5.2.1.1 目的基因和内参基因的PCR扩增产物电泳分析 | 第114-115页 |
| 5.2.1.2 目的基因和内参基因的融解曲线分析 | 第115-116页 |
| 5.2.1.3 目的基因和内参基因的PCR扩增曲线 | 第116-119页 |
| 5.2.1.4 目的基因和内参基因的标准曲线 | 第119-120页 |
| 5.2.1.5 目的基因与管家基因的原始定量结果 | 第120-122页 |
| 5.2.1.6 目的基因与管家基因的相对定量结果 | 第122-123页 |
| 5.2.2 Bruceine D在接种后不同时间对TMV基因组RNA复制的影响 | 第123-126页 |
| 5.2.2.1 目的基因与管家基因real time-PCR扩增曲线 | 第123-124页 |
| 5.2.2.2 目的基因和内参基因的标准曲线 | 第124-125页 |
| 5.2.2.3 目的基因与管家基因的原始定量结果 | 第125页 |
| 5.2.2.4 目的基因与管家基因的相对定量结果 | 第125-126页 |
| 5.2.3 Bruceine D对TMV-RNA在寄主体内移动的影响 | 第126-128页 |
| 5.2.3.1 目的基因和内参基因的PCR扩增曲线 | 第126-127页 |
| 5.2.3.2 目的基因和内参基因的标准曲线 | 第127页 |
| 5.2.3.3 目的基因与管家基因的原始定量结果 | 第127-128页 |
| 5.2.3.4 目的基因与管家基因的相对定量结果 | 第128页 |
| 5.2.4 接种不同时间段Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响 | 第128-130页 |
| 5.2.4.1 半定量RT-PCR条件的优化 | 第128-130页 |
| 5.2.4.2 接种不同时间Bruceine D处理对TMV基因组复制的影响 | 第130页 |
| 5.2.5 Bruceine D对TMV-CP增殖的影响 | 第130-131页 |
| 5.2.6 Bruceine D对TMV在寄主植株中移动及症状表现的影响 | 第131页 |
| 5.2.7 Bruceine D对接种后不同时间段TMV增殖情况的影响 | 第131-132页 |
| 5.2.8 接种TMV不同时间后处理对TMV增殖的影响 | 第132页 |
| 5.2.9 Bruceine D对TMV-MP表达的影响 | 第132-133页 |
| 5.2.10 Bruceine D在细胞水平对TMV增殖的抑制情况 | 第133-134页 |
| 5.2.10.1 TMV侵染及Bruceine D处理对悬浮细胞的影响 | 第133页 |
| 5.2.10.2 Bruceine D处理后不同时间段对TMV在细胞内增殖影响 | 第133-134页 |
| 5.3 讨论 | 第134-139页 |
| 5.3.1 real time-PCR检测Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响 | 第134-135页 |
| 5.3.2 半定量PCR检测Bruceine D对TMV基因组RNA复制的影响 | 第135-136页 |
| 5.3.3 Bruceine D在寄主体内抗TMV增殖的作用机制 | 第136-139页 |
| 6 Bruceine D对烟草抗TMV的诱导抗性及免疫作用 | 第139-155页 |
| 6.1 材料与方法 | 第139-143页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第139页 |
| 6.1.2 Bruceine D对烟草相关防御酶活性的测定 | 第139-140页 |
| 6.1.2.1 酶液提取 | 第139页 |
| 6.1.2.2 POD活性测定 | 第139页 |
| 6.1.2.3 PPO活性测定 | 第139-140页 |
| 6.1.2.4 PAL活性测定 | 第140页 |
| 6.1.2.5 SOD活性测定 | 第140页 |
| 6.1.2.6 β-1,3-葡聚糖酶的测定 | 第140页 |
| 6.1.3 Bruceine D对寄主叶绿素、丙二醛及POD、PPO同工酶的影响 | 第140-141页 |
| 6.1.3.1 处理和取样 | 第140页 |
| 6.1.3.2 叶绿素含量的测定 | 第140-141页 |
| 6.1.3.3 MDA含量测定 | 第141页 |
| 6.1.3.4 对PPO、POD两种同工酶的电泳分析 | 第141页 |
| 6.1.4 Bruceine D对寄主可溶性糖及可溶性蛋白含量的影响 | 第141-143页 |
| 6.1.4.1 处理和取样 | 第142页 |
| 6.1.4.2 采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量 | 第142页 |
| 6.1.4.3 Bruceine D对寄主可溶性蛋白含量的影响 | 第142-143页 |
| 6.1.5 Bruceine D对烟草PR蛋白的诱导 | 第143页 |
| 6.1.5.1 处理和取样 | 第143页 |
| 6.1.5.2 PR蛋白的提取及电泳 | 第143页 |
| 6.2 结果与分析 | 第143-152页 |
| 6.2.1 Bruceine D对烟草体内防御酶的影响 | 第143-146页 |
| 6.2.1.1 POD活性的变化 | 第143-144页 |
| 6.2.1.2 PPO活性的变化 | 第144-145页 |
| 6.2.1.3 PAL活性的变化 | 第145页 |
| 6.2.1.4 SOD活性的变化 | 第145-146页 |
| 6.2.1.5 β-1,3-葡聚糖酶活性的变化 | 第146页 |
| 6.2.2 Bruceine D对烟草叶绿素、MDA及PPO、POD同工酶的影响 | 第146-149页 |
| 6.2.2.1 对叶绿素的影响 | 第146-147页 |
| 6.2.2.2 对MDA含量的影响 | 第147-148页 |
| 6.2.2.3 对PPO、POD同工酶的影响 | 第148-149页 |
| 6.2.3 Bruceine D对寄主可溶性糖及可溶性蛋白含量的影响 | 第149-151页 |
| 6.2.3.1 可溶性糖标准曲线的绘制 | 第149页 |
| 6.2.3.2 对寄主可溶性糖含量的影响 | 第149-150页 |
| 6.2.3.3 可溶性蛋白标准曲线的绘制 | 第150页 |
| 6.2.3.4 对寄主可溶性蛋白含量的影响 | 第150-151页 |
| 6.2.4 Bruceine D对烟草PR蛋白的诱导 | 第151-152页 |
| 6.3 讨论 | 第152-155页 |
| 6.3.1 Bruceine D系统性诱导寄主防御酶活性的提高 | 第152-153页 |
| 6.3.2 Bruceine D能够保护寄主叶绿体 | 第153页 |
| 6.3.3 Bruceine D能够诱导烟草产生新的同工酶 | 第153页 |
| 6.3.4 Bruceine D减轻TMV感染造成的可溶性糖和蛋白含量的降低 | 第153-154页 |
| 6.3.5 Bruceine D能诱导烟草产生新的病程相关蛋白 | 第154-155页 |
| 7 Bruceine D对CMV在寄主体内增殖的作用 | 第155-165页 |
| 7.1 材料与方法 | 第155-157页 |
| 7.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物 | 第155页 |
| 7.1.2 供试仪器和试剂 | 第155-156页 |
| 7.1.3 Bruceine D对CMV核酸复制影响的real time-PCR检测 | 第156-157页 |
| 7.1.3.1 Bruceine D对CMV基因组及亚基因组复制的影响 | 第156页 |
| 7.1.3.2 引物的合成 | 第156页 |
| 7.1.3.3 RNA的反转录反应 | 第156页 |
| 7.1.3.4 目的基因及内参基因标准曲线的建立 | 第156-157页 |
| 7.1.3.5 处理及未处理样品中目的基因的相对定量 | 第157页 |
| 7.1.4 Bruceine D对CMV病毒粒体在寄主体内增殖的影响 | 第157页 |
| 7.2 结果与分析 | 第157-163页 |
| 7.2.1 目的基因和内参基因的融解曲线分析 | 第157-158页 |
| 7.2.2 目的基因和内参基因的PCR扩增曲线 | 第158-159页 |
| 7.2.3 目的基因和内参基因的标准曲线 | 第159-160页 |
| 7.2.4 目的基因与管家基因的原始定量结果 | 第160-163页 |
| 7.2.5 Bruceine D对CMV病毒粒体在寄主体内增殖的影响 | 第163页 |
| 7.3 讨论 | 第163-165页 |
| 8 三萜及三萜皂甙类化合物抗TMV活性及构效关系 | 第165-176页 |
| 8.1 材料和方法 | 第165页 |
| 8.1.1 供试寄主、供试毒源及供试植物 | 第165页 |
| 8.1.2 三萜类及三萜皂甙类供试化合物 | 第165页 |
| 8.1.3 三萜及三萜皂甙类化合物抗TMV增殖活性测定 | 第165页 |
| 8.2 结果与分析 | 第165-168页 |
| 8.2.1 67个三萜及三萜皂甙类化合物抗TMV增殖活性 | 第165页 |
| 8.2.2 活性化合物的抑制中浓度 | 第165-168页 |
| 8.3 讨论 | 第168-176页 |
| 9 总结与讨论 | 第176-179页 |
| 9.1 抗植物病毒是quassinoids的一种新的生物活性 | 第176页 |
| 9.2 TMV-MP的原核表达及特异性抗体制备 | 第176页 |
| 9.3 明确了quassinoids体外和体内的抗TMV机制 | 第176-177页 |
| 9.4 Quassinoids特异性抑制TMV在寄主体内的增殖 | 第177-178页 |
| 9.5 Quassinoids能够诱导寄主抗病性并具有保护作用 | 第178页 |
| 9.6 进行了quassinoids抗TMV的SAR分析 | 第178页 |
| 9.7 进行了三萜类化合物抗TMV的SAR分析 | 第178-179页 |
| 参考文献 | 第179-193页 |
| 附录1 缩略语及含义 | 第193-196页 |
| 附录2 攻博期间发表及投稿的论文 | 第196-198页 |
| 致谢 | 第198页 |
