| 中文摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 前言 | 第14-20页 |
| 1. 甲型流感病毒的概况 | 第14-16页 |
| 2. 流感病毒核蛋白 | 第16-17页 |
| 3. 本研究主要实验原理 | 第17-19页 |
| 4. 研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 第一章 NP的B细胞表位预测分析 | 第20-27页 |
| 第一节 材料与方法 | 第20-21页 |
| 1. NP氨基酸序列 | 第20页 |
| 2. NP蛋白二级结构预测 | 第20页 |
| 3. NP蛋白亲水性分析 | 第20-21页 |
| 4. NP蛋白柔韧性分析 | 第21页 |
| 5. NP蛋白可及性分析 | 第21页 |
| 6. NP 细胞抗原表位的预测分析 | 第21页 |
| 第二节 结果与分析 | 第21-25页 |
| 1. NP氨基酸序列 | 第21-22页 |
| 2. NP二级结构预测 | 第22-23页 |
| 3. NP亲水性分析 | 第23页 |
| 4. NP蛋白柔韧性分析 | 第23-24页 |
| 5. NP 表面可及性分析 | 第24页 |
| 6. NP 蛋白抗原表位预测 | 第24-25页 |
| 第三节 结论与讨论 | 第25-27页 |
| 第二章 甲型流感病毒NP蛋白的原核表达 | 第27-40页 |
| 第一节 材料与方法 | 第27-33页 |
| 1. 菌株与质粒 | 第27页 |
| 2. 主要仪器 | 第27页 |
| 3. 试剂 | 第27-28页 |
| 4. 构建原核表达质粒PET-28A-NP | 第28-30页 |
| 4.1 引物设计与合成 | 第28页 |
| 4.2 目的基因扩增 | 第28页 |
| 4.3 NP目的片段与原核表达载体的双酶切与鉴定 | 第28-29页 |
| 4.4 NP目的片段与原核表达载体的连接反应与鉴定 | 第29页 |
| 4.5 连接产物转化克隆菌 | 第29页 |
| 4.6 质粒提取与重组质粒鉴定 | 第29-30页 |
| 5. 重组 NP 蛋白表达 | 第30-32页 |
| 5.1 重组质粒转化表达菌 | 第30页 |
| 5.2 NP蛋白小量诱导表达 | 第30-31页 |
| 5.3 NP蛋白大量诱导表达 | 第31页 |
| 5.4 NP蛋白纯化浓缩 | 第31-32页 |
| 6. 重组NP蛋白鉴定 | 第32-33页 |
| 6.1 重组 NP 蛋白的 Western 鉴定 | 第32页 |
| 6.2 重组NP蛋白的ELISA鉴定 | 第32-33页 |
| 第二节 结果与分析 | 第33-38页 |
| 1. 引物设计 | 第33页 |
| 2. 目的基因扩增 | 第33页 |
| 3. PET-28A-NP质粒构建与表达 | 第33-34页 |
| 4. NP蛋白小量诱导表达条件的优化 | 第34-35页 |
| 5. NP蛋白可溶性分析 | 第35页 |
| 6. NP蛋白镍柱纯化 | 第35-37页 |
| 7. 目的蛋白的WESTERN-BLOT鉴定 | 第37页 |
| 8. 目的蛋白的ELISA鉴定 | 第37-38页 |
| 第三节 结论与讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 抗NP单克隆抗体的制备 | 第40-48页 |
| 第一节 材料与方法 | 第40-44页 |
| 1. 细胞株、实验动物和病毒 | 第40页 |
| 2. 试剂 | 第40页 |
| 3. 抗原乳化 | 第40-41页 |
| 4. 动物免疫 | 第41页 |
| 5. 杂交瘤细胞制备 | 第41-42页 |
| 6. 抗NP单克隆抗体制备 | 第42页 |
| 7. 抗NP单克隆抗体纯化 | 第42-43页 |
| 8. 抗NP单克隆抗体标记HRP | 第43页 |
| 9. 单克隆抗体检测 | 第43-44页 |
| 9.1 单克隆抗体的WESTERN-BLOT鉴定 | 第43页 |
| 9.2 间接ELISA法抗体效价检测 | 第43-44页 |
| 第二节 结果与分析 | 第44-46页 |
| 1. 单克隆抗体的WESTERN-BLOT鉴定 | 第44页 |
| 2. 单克隆抗体纯化 | 第44-45页 |
| 3. 单克隆抗体标记HRP及Wester-blot鉴定 | 第45-46页 |
| 4. 纯化抗体效价检测 | 第46页 |
| 第三节 结论与讨论 | 第46-48页 |
| 第四章 抗NP单克隆抗体的初步应用 | 第48-57页 |
| 第一节 材料与方法 | 第48-50页 |
| 1. 病毒株和细胞株 | 第48页 |
| 2. 试剂 | 第48页 |
| 3. ELISA法检测流感病毒 | 第48-49页 |
| 3.1 间接ELISA法鉴定流感病毒 | 第48-49页 |
| 3.2 双抗夹心法ELISA检测流感病毒 | 第49页 |
| 3.2.1 确认MEMPHIS抗体包被浓度 | 第49页 |
| 3.2.2 双抗夹心ELISA法和直接ELISA检测Memphis病毒的敏感度比较 | 第49页 |
| 4. 间接免疫染色法检测侵染细胞的流感病毒 | 第49页 |
| 5. 细胞免疫荧光法进行 NP 蛋白亚细胞定位 | 第49-50页 |
| 5.1 PR8病毒侵染下的NP蛋白亚细胞定位 | 第49页 |
| 5.2 PCDNA3.1-NP真核质粒转染下的NP蛋白亚细胞定位 | 第49-50页 |
| 第二节 结果与分析 | 第50-54页 |
| 1. 间接ELISA法用于流感病毒的测定 | 第50页 |
| 2. 与抗MEMPHIS抗体组成ELISA双抗夹心法检测流感病毒 | 第50-51页 |
| 2.1 确认MEMPHIS抗体包被饱和浓度 | 第50-51页 |
| 2.2 双抗夹心ELISA法检测MEMPHIS病毒 | 第51页 |
| 3. 间接免疫染色法检测细胞内的流感病毒 | 第51-52页 |
| 4. 抗NP MAB可以进行NP蛋白的亚细胞定位 | 第52-54页 |
| 4.1 不同时间下PR8感染MDCK的NP亚细胞定位 | 第52-53页 |
| 4.2 不同时间下PCDNA3.1-NP质粒转染MDCK细胞的NP亚细胞定位 | 第53-54页 |
| 第三节 结论与讨论 | 第54-57页 |
| 第五章 总结与展望 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-63页 |
| 综述 H9N2亚型流感病毒的生物学特性及其潜在危险性 | 第63-70页 |
| 参考文献 | 第67-70页 |
| 附件 1 攻读学位期间发表论文目录 | 第70-71页 |
| 附件 2 溶液配方 | 第71-73页 |
