| 致谢 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩写清单 | 第15-17页 |
| 1 引言 | 第17-18页 |
| 2 文献综述 | 第18-28页 |
| 2.1 丝绸之路病的流行病学 | 第18-20页 |
| 2.2 丝绸之路病研究进展 | 第20-21页 |
| 2.2.1 遗传因素在丝绸之路病发病机理中的作用 | 第20-21页 |
| 2.2.2 感染与丝绸之路病发病机制 | 第21页 |
| 2.3 丝绸之路病自身抗原研究进展 | 第21-26页 |
| 2.4 研究内容与意义 | 第26-28页 |
| 3 从人脐带静脉内皮细胞中筛选丝绸之路病自身抗原 | 第28-55页 |
| 3.1 实验材料 | 第28-32页 |
| 3.1.1 主要实验材料 | 第28-30页 |
| 3.1.2 主要试剂的配制 | 第30-32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-47页 |
| 3.2.1 脐带静脉原代内皮细胞的分离 | 第32-33页 |
| 3.2.2 原代细胞传代 | 第33页 |
| 3.2.3 原代内皮细胞的低温储藏 | 第33-34页 |
| 3.2.4 细胞复苏 | 第34页 |
| 3.2.5 RNA提取和逆转录 | 第34-35页 |
| 3.2.6 间接免疫荧光 | 第35-36页 |
| 3.2.7 免疫印迹筛选自身抗原 | 第36-38页 |
| 3.2.8 自身抗原的载体构建与表达纯化 | 第38-44页 |
| 3.2.9 蛋白质的质谱分析 | 第44-45页 |
| 3.2.10 免疫印迹验证和ELISA | 第45-46页 |
| 3.2.11 ELISA的数据分析 | 第46-47页 |
| 3.3 实验结果 | 第47-53页 |
| 3.3.1 脐带静脉原代内皮细胞的分离与培养 | 第47-48页 |
| 3.3.2 间接免疫荧光结果 | 第48页 |
| 3.3.3 免疫印迹筛选结果 | 第48-49页 |
| 3.3.4 免疫共沉淀筛选结果 | 第49页 |
| 3.3.5 质谱鉴定结果 | 第49-50页 |
| 3.3.6 ETFB引物设计,载体构建,蛋白表达 | 第50-51页 |
| 3.3.7 ELISA结果和免疫印迹验证 | 第51-53页 |
| 3.3.8 ETFB抗体与临床对应关系 | 第53页 |
| 3.4 小结 | 第53-55页 |
| 4 用于自身抗原筛选的靶细胞的筛选 | 第55-61页 |
| 4.1 实验材料 | 第56-57页 |
| 4.2 实验方法 | 第57-58页 |
| 4.2.1 细胞的培养 | 第57-58页 |
| 4.2.2 细胞芯片的制作与检测方法 | 第58页 |
| 4.3 实验结果和小结 | 第58-61页 |
| 5 Anneixn A2是位于细胞膜上的丝绸之路病关键自身抗原 | 第61-82页 |
| 5.1 实验方法 | 第61-66页 |
| 5.1.1 EA.hy926细胞的膜蛋白ELISA实验 | 第61页 |
| 5.1.2 在EA.hy926细胞的膜蛋白中筛选丝绸之路病的自身抗原 | 第61-62页 |
| 5.1.3 Annexin A2蛋白的表达纯化 | 第62-64页 |
| 5.1.4 免疫共沉淀 | 第64页 |
| 5.1.5 免疫组化 | 第64-65页 |
| 5.1.6 间接免疫荧光抑制试验 | 第65页 |
| 5.1.7 抗体的协同性ELISA检测 | 第65-66页 |
| 5.1.8 统计方法 | 第66页 |
| 5.2 实验结果 | 第66-79页 |
| 5.2.1 特异性自身抗原的鉴定 | 第66-69页 |
| 5.2.2 Annexin A2作为自身抗原的验证 | 第69-74页 |
| 5.2.3 Annexin A2自身抗体在丝绸之路病人中的分布以及与HSP60抗体的协同性检测 | 第74-75页 |
| 5.2.4 Annexin A2蛋白在人不同组织中的分布定位情况 | 第75-78页 |
| 5.2.5 Annexin A2的临床价值发掘 | 第78-79页 |
| 5.3 小结 | 第79-82页 |
| 6 个体化全蛋白质组芯片在丝绸之路病自身抗原筛选中的应用 | 第82-95页 |
| 6.1 个体化全蛋白质芯片的概念 | 第82-83页 |
| 6.2 芯片实验材料和基本条件选择 | 第83-86页 |
| 6.2.1 基片与点样缓冲液选择 | 第83-84页 |
| 6.2.2 洗针条件 | 第84页 |
| 6.2.3 预点个数、点样间距、单针最大点样数 | 第84-85页 |
| 6.2.4 芯片印迹的内标选择 | 第85-86页 |
| 6.3 实验方法 | 第86-91页 |
| 6.3.1 细胞的培养和蛋白质提取 | 第87-88页 |
| 6.3.2 双向凝胶电泳 | 第88-89页 |
| 6.3.3 个体化全蛋白组芯片的制备 | 第89-90页 |
| 6.3.4 芯片上蛋白点的鉴定 | 第90页 |
| 6.3.5 数据分析 | 第90-91页 |
| 6.4 实验结果 | 第91-93页 |
| 6.4.1 HaCaT细胞个体化全蛋白质组芯片的制备 | 第91-92页 |
| 6.4.2 HaCaT个体化全蛋白质组芯片筛选丝绸之路病自身抗原 | 第92-93页 |
| 6.5 小结 | 第93-95页 |
| 7 利用生物信息学筛选丝绸之路病自身抗原 | 第95-105页 |
| 7.1 实验材料 | 第96-97页 |
| 7.2 实验方法 | 第97-98页 |
| 7.2.1 实验样本 | 第97页 |
| 7.2.2 抗原肽段比较和空间结构比较 | 第97页 |
| 7.2.3 斑点ELISA (Dot-ELISA) | 第97-98页 |
| 7.2.4 免疫共沉淀反应与质谱连用 | 第98页 |
| 7.3 实验结果 | 第98-103页 |
| 7.3.1 HnNRNP A1的生物信息学分析 | 第98-100页 |
| 7.3.2 免疫学方法验证hnRNP A1为该病的自身抗原 | 第100-103页 |
| 7.4 小结 | 第103-105页 |
| 8 高分辨率生物质谱在丝绸之路病自身抗原筛选领域中的应用 | 第105-120页 |
| 8.1 质谱与生物质谱简介 | 第105-107页 |
| 8.2 实验材料 | 第107-108页 |
| 8.3 实验方法 | 第108-110页 |
| 8.3.1 实验方法的建立 | 第108页 |
| 8.3.2 自身抗原的筛选 | 第108-110页 |
| 8.4 实验结果 | 第110-118页 |
| 8.4.1 实验方法的建立 | 第110-111页 |
| 8.4.2 实验用血清的选择 | 第111-113页 |
| 8.4.3 自身抗原的筛选数据 | 第113-116页 |
| 8.4.4 自身抗原的验证 | 第116-118页 |
| 8.5 小结 | 第118-120页 |
| 9 噬菌体展示技术在丝绸之路病自身抗原筛选中的应用 | 第120-126页 |
| 9.1 实验材料 | 第120-121页 |
| 9.1.1 主要试剂的配制 | 第121页 |
| 9.2 实验流程 | 第121-123页 |
| 9.2.1 ER2738 F+菌落的筛选与培养 | 第121页 |
| 9.2.2 M13噬菌体滴度(浓度)的测定方法 | 第121-122页 |
| 9.2.3 Protein A/G筛选流程 | 第122-123页 |
| 9.2.4 测序前的准备 | 第123页 |
| 9.3 实验结果与讨论 | 第123-126页 |
| 9.3.1 三轮淘选结果 | 第123-124页 |
| 9.3.2 三轮淘选后对噬菌体进行测序结果 | 第124-126页 |
| 10 自身抗原与感染的关系 | 第126-134页 |
| 10.1 实验材料 | 第126-127页 |
| 10.2 实验方法 | 第127-129页 |
| 10.2.1 样本信息 | 第127页 |
| 10.2.2 细胞系培养和染色 | 第127-128页 |
| 10.2.3 细菌刺激 | 第128页 |
| 10.2.4 免疫印迹 | 第128页 |
| 10.2.5 免疫共沉淀 | 第128-129页 |
| 10.2.6 胶内酶切与质谱鉴定: | 第129页 |
| 10.2.7 HSP27蛋白表达纯化 | 第129页 |
| 10.2.8 ELISA测试的条件 | 第129页 |
| 10.3 实验结果 | 第129-132页 |
| 10.3.1 新的自身抗原的筛选与鉴定 | 第129-130页 |
| 10.3.2 HSP27作为丝绸之路病自身抗原的验证 | 第130-131页 |
| 10.3.3 丝绸之路病患者中HSP27抗体存在的频率 | 第131-132页 |
| 10.4 讨论 | 第132-134页 |
| 11 抗原的优化与转化医学研究 | 第134-140页 |
| 11.1 丝绸之路病人临床信息收集数据库 | 第134-136页 |
| 11.2 丝绸之路病ELISA试剂盒的研制 | 第136-137页 |
| 11.3 自身抗原的真核表达 | 第137-140页 |
| 12 课题总结 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-155页 |
| 附录A ETFB的免疫抑制荧光图 | 第155页 |
| 附录B ETFB IgA抗体在丝绸之路病患者中的分布 | 第155-156页 |
| 附录C ETFB,HSP60,HnRNP A2/B1 IgA抗体在丝绸之路病患者中的协同性检测 | 第156-157页 |
| 附录D ETFB的三个疑似抗原位点在其三维结构中的位置 | 第157-158页 |
| 附录E 对照疾病的细胞芯片荧光模式图 | 第158-161页 |
| 附录F HaCaT细胞全蛋白质组芯片点样矩阵 | 第161-162页 |
| 附录G 噬菌体测序结果 | 第162-166页 |
| 作者简历及在学研究成果 | 第166-170页 |
| 学位论文数据集 | 第170页 |
