| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第1章 引言 | 第10-15页 |
| 1.1 人类胚胎干细胞是理想的种子细胞 | 第10页 |
| 1.2 个体化定制的诱导多能干细胞 | 第10-11页 |
| 1.3 异体移植的免疫排斥 | 第11-12页 |
| 1.4 利用新型基因打靶技术建立低免疫原性hESC | 第12-15页 |
| 1.4.1 锌指核酸酶（ZFNS）技术 | 第12-13页 |
| 1.4.2 类转录激活因子效应物核酸酶(TALENS)技术 | 第13页 |
| 1.4.3 规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/CAS9)技术 | 第13-15页 |
| 第2章 实验材料 | 第15-18页 |
| 2.1 细胞 | 第15页 |
| 2.2 菌株 | 第15页 |
| 2.3 质粒 | 第15页 |
| 2.4 主要试剂和试剂盒 | 第15-16页 |
| 2.5 抗体 | 第16页 |
| 2.6 主要实验仪器 | 第16-18页 |
| 第3章 实验方法 | 第18-42页 |
| 3.1 细胞培养相关试剂的配置 | 第18页 |
| 3.1.1 人类胚胎干细胞培养液 | 第18页 |
| 3.1.2 人类胚胎干细胞冻存液 | 第18页 |
| 3.1.3 小鼠成纤维细胞培养液 | 第18页 |
| 3.1.4 小鼠成纤维细胞冻存液 | 第18页 |
| 3.2 分子克隆相关试剂的配置 | 第18-19页 |
| 3.2.1 LB培养基 | 第18页 |
| 3.2.2 LB平板 | 第18-19页 |
| 3.2.3 Mg2+ 溶液 | 第19页 |
| 3.2.4 蔗糖溶液 | 第19页 |
| 3.2.5 SOB培养基配制 | 第19页 |
| 3.2.6 RF1:180ml的配制 | 第19页 |
| 3.2.7 RF2的配制 | 第19页 |
| 3.3 感受态细菌的制备 | 第19-20页 |
| 3.4 人类胚胎干细胞的饲养层细胞—小鼠胚胎成纤维细胞的相关培养 | 第20-23页 |
| 3.4.1 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养 | 第20-22页 |
| 3.4.2 小鼠胚胎成纤维细胞的冻存 | 第22页 |
| 3.4.3 小鼠胚胎成纤维细胞的复苏 | 第22页 |
| 3.4.4 小鼠胚胎成纤维细胞的传代 | 第22-23页 |
| 3.4.5 饲养层细胞的制备 | 第23页 |
| 3.5 人类胚胎干细胞的培养 | 第23-25页 |
| 3.5.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集 | 第23-24页 |
| 3.5.2 人类胚胎干细胞的复苏 | 第24页 |
| 3.5.3 人类胚胎干细胞的传代 | 第24-25页 |
| 3.6 基因组抽提 | 第25-26页 |
| 3.7 PCR及PCR产物纯化 | 第26页 |
| 3.7.1 PCR体系 | 第26页 |
| 3.7.2 PCR产物纯化 | 第26页 |
| 3.8 免疫印迹 | 第26-29页 |
| 3.8.1 免疫印迹相关试剂准备 | 第26-27页 |
| 3.8.2 免疫印迹相关溶液的配制 | 第27-28页 |
| 3.8.3 免疫印迹的步骤 | 第28-29页 |
| 3.8.3.1 蛋白质样品获取 | 第28页 |
| 3.8.3.2 电泳 | 第28-29页 |
| 3.8.3.3 电转 | 第29页 |
| 3.8.3.4 免疫反应 | 第29页 |
| 3.8.3.5 发光检测 | 第29页 |
| 3.9 建立HLA-A敲除的人类胚胎干细胞系的方法 | 第29-36页 |
| 3.9.1 从NCBI上下载HLA-A基因序列 | 第29-30页 |
| 3.9.2 设计引物，PCR扩增基因组上打靶位点片段并测序 | 第30-32页 |
| 3.9.2.1 引物设计 | 第30-31页 |
| 3.9.2.2 PCR扩增基因组上打靶位点片段并测序 | 第31-32页 |
| 3.9.3 设计靶向敲除HLA-A基因的TALENS | 第32-33页 |
| 3.9.3.1 测序确定 HLA-A的序列 | 第32页 |
| 3.9.3.2 在HLA-AEXON2上设计TALEN识别位点及序列 | 第32-33页 |
| 3.9.4 在人类胚胎干细胞系X2里进行HLA-A基因打靶 | 第33-35页 |
| 3.9.4.1 TALENS转染人类胚胎干细胞系X2细胞验证TALENS打靶效率 | 第33-35页 |
| 3.9.4.2 挑克隆测序并计算TALEN的打靶效率 | 第35页 |
| 3.9.5 在人类胚胎干细胞X2中建立敲除HLA-A基因的单克隆细胞系 | 第35-36页 |
| 3.10 建立HLA-B5101敲除的人类胚胎干细胞系的方法 | 第36-42页 |
| 3.10.1 步骤同 HLA-A，从 NCBI 上下载 HLA-B 基因序列 | 第36页 |
| 3.10.2 设计引物，PCR扩增基因组上打靶位点片段并测序设计TELENS | 第36-39页 |
| 3.10.3 挑克隆测序并计算TALENS的把靶效率 | 第39-40页 |
| 3.10.4 在HLA-A基因敲除的人类胚胎干细胞X2 | 第40-42页 |
| 第4章 实验结果与讨论 | 第42-47页 |
| 4.1 建立 HLA-A 敲除的人类胚胎干细胞系 | 第42-44页 |
| 4.1.1 构建靶向HLA-A的TALEN | 第42页 |
| 4.1.2 在人类胚胎干细胞系X2中检测TALEN效率 | 第42-43页 |
| 4.1.3 建立HLA-A敲除的人类胚胎干细胞系 | 第43页 |
| 4.1.4 HLA-A基因敲除人类胚胎干细胞的HLA I类分子表达情况 | 第43-44页 |
| 4.1.4.1 DNA水平 | 第43页 |
| 4.1.4.2 蛋白水平 | 第43-44页 |
| 4.2 在HLA-A基因敲除的人类胚胎干细胞X2中建立敲除HLA-B5101基因的单克隆细胞系 | 第44-47页 |
| 4.2.1 设计靶向敲除HLA-B5101基因的TALENS | 第44页 |
| 4.2.2 筛选出有活性的TALENS | 第44-45页 |
| 4.2.3 在HLA-A基因敲除的人类胚胎干细胞X2中建立敲除HLA-B5101基因的单克隆细胞系 | 第45-47页 |
| 第5章 总结与展望 | 第47-49页 |
| 5.1 成功利用TALENS把靶技术将人类胚胎干细胞的HLA-A基因高效敲除 | 第47页 |
| 5.2 HLA-A基因敲除的人类胚胎干细胞不表达HLA-A蛋白 | 第47页 |
| 5.3 在HLA-A基因敲除的基础上获得了HLA-B5101敲除的人类胚胎干细胞 | 第47-49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
| 附录 | 第54-58页 |
| 附录1 发表的论文 | 第54页 |
| 附录2 测序得到的人胚胎干细胞系X2的HLA-A、B序列HLA-A 0201的序列 | 第54-58页 |
