| 中文摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-16页 |
| 1 前言 | 第17-35页 |
| 1.0 乙烯生物合成及调节机制 | 第17-19页 |
| 1.0.1 乙烯生物合成途径 | 第17-18页 |
| 1.0.2 乙烯生物合成的调控 | 第18-19页 |
| 1.0.2.1 ACC合成酶及编码基因 | 第18页 |
| 1.0.2.2 ACC氧化酶及编码基因 | 第18-19页 |
| 1.1 乙烯生物合成与果实成熟软化 | 第19-21页 |
| 1.1.1 ACS与果实成熟 | 第19-20页 |
| 1.1.1.1 ACS1与果实成熟 | 第19-20页 |
| 1.1.1.2 ACS3a与果实成熟 | 第20页 |
| 1.2.2 ACO与果实成熟 | 第20-21页 |
| 1.2 乙烯的信号转导途径 | 第21-25页 |
| 1.2.1 乙烯信号的感知 | 第21-22页 |
| 1.2.1.1 乙烯受体 | 第21页 |
| 1.2.1.2 乙烯受体与果实成熟 | 第21-22页 |
| 1.2.2 乙烯信号的转导 | 第22-25页 |
| 1.2.2.1 CTR1 | 第22页 |
| 1.2.2.1.1 CTR1结构和功能 | 第22页 |
| 1.2.2.1.2 CTR1与果实成熟 | 第22页 |
| 1.2.2.2 EIN2 | 第22-23页 |
| 1.2.2.2.1 EIN2结构和功能 | 第22-23页 |
| 1.2.2.2.2 EIN2与果实成熟 | 第23页 |
| 1.2.2.3 EIN3/EILs | 第23-24页 |
| 1.2.2.3.1 EIN3/EILs结构和功能 | 第23-24页 |
| 1.2.2.3.2 EIN3/EILs与果实成熟 | 第24页 |
| 1.2.2.4 ERFs | 第24-25页 |
| 1.2.2.4.1 ERFs结构和功能 | 第24-25页 |
| 1.2.2.4.2 ERFs与果实成熟 | 第25页 |
| 1.3 细胞壁代谢与果实成熟软化 | 第25-31页 |
| 1.3.1 细胞壁的结构、化学组成与果实成熟软化 | 第25-27页 |
| 1.3.1.1 细胞壁的结构与果实成熟软化 | 第25-26页 |
| 1.3.1.2 细胞壁的化学组成与果实成熟软化 | 第26-27页 |
| 1.3.2 细胞壁代谢酶与果实成熟软化 | 第27-31页 |
| 1.3.2.1 果胶甲酯酶 | 第27-28页 |
| 1.3.2.2 多聚半乳糖醛酸酶 | 第28-29页 |
| 1.3.2.3 β-半乳糖苷酶 | 第29页 |
| 1.3.2.4 木葡聚糖内糖基转移酶 | 第29-30页 |
| 1.3.2.5 纤维素酶 | 第30-31页 |
| 1.4 抑制性差减杂交技术（SSH）研究进展 | 第31-33页 |
| 1.4.1 SSH技术原理及特点 | 第31-33页 |
| 1.4.2 SSH技术的应用 | 第33页 |
| 1.5 研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 1.6 研究的主要内容 | 第34-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-55页 |
| 2.1 试验材料 | 第35-36页 |
| 2.1.1 植物材料及生长条件 | 第35页 |
| 2.1.2 菌株和质粒 | 第35页 |
| 2.1.3 酶、生化试剂及试剂盒 | 第35页 |
| 2.1.4 PCR引物 | 第35-36页 |
| 2.2 实验方法 | 第36-55页 |
| 2.2.1 果实硬度的测定 | 第36页 |
| 2.2.2 乙烯释放量的测定 | 第36页 |
| 2.2.3 抑制性差减杂交文库的构建 | 第36-44页 |
| 2.2.3.1 总RNA的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.3.2 mRNA的分离 | 第37-38页 |
| 2.2.3.3 cDNA的合成及酶切 | 第38-40页 |
| 2.2.3.3.1 cDNA第一链的合成 | 第38页 |
| 2.2.3.3.2 cDNA第二链的合成 | 第38-39页 |
| 2.2.3.3.3 RsaI酶切 | 第39-40页 |
| 2.2.3.4 接头连接及连接效率验证 | 第40-41页 |
| 2.2.3.4.1 接头连接 | 第40页 |
| 2.2.3.4.2 连接效率验证 | 第40-41页 |
| 2.2.3.5 差减杂交 | 第41-42页 |
| 2.2.3.5.1 第一轮差减杂交 | 第41页 |
| 2.2.3.5.2 第二轮差减杂交 | 第41-42页 |
| 2.2.3.6 抑制PCR及载体连接、转化 | 第42-43页 |
| 2.2.3.6.1 第一轮抑制PCR | 第42页 |
| 2.2.3.6.2 第二轮抑制PCR | 第42页 |
| 2.2.3.6.3 PCR产物的纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.3.6.4 连接及转化 | 第43页 |
| 2.2.3.7 差减文库的鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.3.7.1 库容量的鉴定 | 第43页 |
| 2.2.3.7.2 重组率和插入片段长度鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.4 酶的提取及活性测定 | 第44-46页 |
| 2.2.4.1 酶的提取 | 第44页 |
| 2.2.4.1.1 β-半乳糖苷酶和纤维素酶的提取 | 第44页 |
| 2.2.4.1.2 木葡聚糖内糖基转移酶和淀粉酶的提取 | 第44页 |
| 2.2.4.2 酶活性的测定 | 第44-46页 |
| 2.2.4.2.1 β-半乳糖苷酶活性测定 | 第44页 |
| 2.2.4.2.2 纤维素酶活性测定 | 第44-45页 |
| 2.2.4.2.3 木葡聚糖内糖基转移酶活性测定 | 第45页 |
| 2.2.4.2.4 淀粉酶活性测定 | 第45-46页 |
| 2.2.6 基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| 2.2.7 荧光定量PCR分析 | 第47-48页 |
| 2.2.8 PCR扩增 | 第48-49页 |
| 2.2.8.1 基因扩增 | 第48页 |
| 2.2.8.2 启动子扩增 | 第48-49页 |
| 2.2.9 PCR产物及酶切产物的回收 | 第49-50页 |
| 2.2.10 连接反应 | 第50页 |
| 2.2.11 转化 | 第50页 |
| 2.2.12 质粒DNA的提取 | 第50-51页 |
| 2.2.13 根癌农杆菌感受态的制备和转化 | 第51-52页 |
| 2.2.13.1 根癌农杆菌感受态的制备 | 第51-52页 |
| 2.2.13.2 根癌农杆菌感受态的转化 | 第52页 |
| 2.2.14 表达载体的构建 | 第52-53页 |
| 2.2.15 番茄的遗传转化 | 第53-54页 |
| 2.2.16 转基因材料的鉴定 | 第54-55页 |
| 3 结果与分析 | 第55-90页 |
| 3.1 质构仪评价苹果果实质地品质的方法优化 | 第55-56页 |
| 3.1.1 果皮和探头对果实硬度的影响 | 第55-56页 |
| 3.1.2 穿刺深度对果实硬度的影响 | 第56页 |
| 3.1.3 穿刺速度对果实硬度的影响 | 第56页 |
| 3.2‘泰山早霞’苹果果实抑制性差减杂交文库的构建及差异基因的分离 | 第56-70页 |
| 3.2.1 果实发育期果实硬度的测定 | 第56-57页 |
| 3.2.2 果实发育期乙烯释放量的测定 | 第57页 |
| 3.2.3 抑制性差减杂交文库材料的确定、总RNA的提取及mRNA的分离 | 第57-58页 |
| 3.2.4 接头连接及连接效率验证 | 第58-59页 |
| 3.2.5 差减后产物的两轮PCR扩增结果 | 第59-60页 |
| 3.2.6 差减效率检测 | 第60页 |
| 3.2.7 抑制性差减杂交文库库容量的鉴定及插入片段长度检测 | 第60-61页 |
| 3.2.7.1 抑制性差减杂交文库库容量的鉴定 | 第60-61页 |
| 3.2.7.2 抑制性差减杂交文库插入片段大小检测 | 第61页 |
| 3.2.8 EST测序及序列拼接 | 第61-62页 |
| 3.2.9 功能注释和分类 | 第62-64页 |
| 3.2.10 果实成熟软化相关基因的分离鉴定 | 第64-67页 |
| 3.2.11 qRT-PCR分析果实成熟软化过程中的差异基因表达 | 第67-70页 |
| 3.3‘泰山早霞’苹果ACS1基因型鉴定及乙烯生物合成基因表达分析 | 第70-72页 |
| 3.3.1 ACS1基因型鉴定 | 第70-71页 |
| 3.3.2 乙烯生物合成基因表达分析 | 第71-72页 |
| 3.4‘泰山早霞’苹果果实成熟软化关键基因的筛选 | 第72-79页 |
| 3.4.1‘泰山早霞’苹果果实发育期果实软化相关酶活性变化 | 第72-74页 |
| 3.4.1.1 β-半乳糖苷酶活性变化 | 第72页 |
| 3.4.1.2 纤维素酶活性变化 | 第72-73页 |
| 3.4.1.3 木葡聚糖内糖基转移酶活性变化 | 第73页 |
| 3.4.1.4 淀粉酶活性变化 | 第73-74页 |
| 3.4.2 1-MCP处理对‘泰山早霞’苹果果实成熟软化的影响 | 第74-79页 |
| 3.4.2.1 1-MCP处理对乙烯释放量的影响 | 第74页 |
| 3.4.2.2 1-MCP处理对果实硬度的影响 | 第74-75页 |
| 3.4.2.3 1-MCP处理对果实软化相关基因表达量的影响 | 第75-79页 |
| 3.4.2.3.1 1-MCP处理乙烯信号途径基因表达量的影响 | 第75-76页 |
| 3.4.2.3.2 1-MCP处理对 β-Gal和 β-Glu基因表达量的影响 | 第76页 |
| 3.4.2.3.3 1-MCP处理对XTH基因家族表达量的影响及时空表达分析 | 第76-78页 |
| 3.4.2.3.4 1-MCP处理对F-box和MADS-box基因表达量的影响 | 第78-79页 |
| 3.5‘泰山早霞’苹果果实软化关键基因及启动子的克隆分析 | 第79-88页 |
| 3.5.1‘泰山早霞’苹果果实软化关键基因全长克隆与序列分析 | 第79-85页 |
| 3.5.1.1 β-Gal基因的克隆及序列分析 | 第79-80页 |
| 3.5.1.2 β-Glu基因的克隆及序列分析 | 第80-81页 |
| 3.5.1.3 XTH2和XTH10基因的克隆及序列分析 | 第81-83页 |
| 3.5.1.3.1 XTH2基因的克隆及序列分析 | 第81-82页 |
| 3.5.1.3.2 XTH10基因的克隆及序列分析 | 第82-83页 |
| 3.5.1.4 F-box基因的克隆及序列分析 | 第83-84页 |
| 3.5.1.5 MADS-box基因的克隆及序列分析 | 第84-85页 |
| 3.5.2‘泰山早霞’苹果果实软化相关基因启动子的克隆与序列分析 | 第85-88页 |
| 3.5.2.1 β-Gal基因启动子的克隆与序列分析 | 第85-86页 |
| 3.5.2.2 β-Glu基因启动子的克隆与序列分析 | 第86-87页 |
| 3.5.2.3 XTH2基因启动子的克隆与序列分析 | 第87-88页 |
| 3.6 番茄转基因功能验证 | 第88-90页 |
| 4 讨论 | 第90-94页 |
| 4.1‘泰山早霞’苹果SSH文库的构建及成熟相关基因的挖掘 | 第90-92页 |
| 4.1.1‘泰山早霞’苹果果实质地软化受乙烯调控 | 第90-91页 |
| 4.1.2‘泰山早霞’苹果果实花青苷合成受乙烯调控 | 第91-92页 |
| 4.1.3‘泰山早霞’苹果果实香气合成受乙烯调控 | 第92页 |
| 4.2 ACS1基因型与果实成熟软化 | 第92-94页 |
| 5 结论 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-111页 |
| 攻读学位期间发表论文情况及发明专利 | 第111-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 附录 | 第113-116页 |
