人己糖胺酶D的酶学特性、生物底物及催化机制的研究
| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1. 前言 | 第13-25页 |
| ·β-N-乙酰己糖胺酶 | 第13-18页 |
| ·组织中β-N-乙酰己糖胺酶的生物学功能 | 第13-15页 |
| ·β-N-乙酰己糖胺酶的分类 | 第15-17页 |
| ·GH3 的β-N-乙酰己糖胺酶 | 第15-16页 |
| ·GH20 的β-N-乙酰己糖胺酶 | 第16-17页 |
| ·GH84 的β-N-乙酰己糖胺酶 | 第17页 |
| ·三类β-N-乙酰葡萄糖胺酶催化机制的联系和区别 | 第17-18页 |
| ·糖基化修饰及其作用 | 第18-20页 |
| ·糖基化修饰的类型 | 第18-19页 |
| ·糖基化修饰的作用 | 第19-20页 |
| ·糖基辍合物的降解 | 第20页 |
| ·人的β-N-乙酰己糖胺酶 | 第20-25页 |
| ·HexA 和 HexB | 第20-22页 |
| ·OGA | 第22-23页 |
| ·HexD | 第23-25页 |
| 2. 材料和方法 | 第25-47页 |
| ·实验材料 | 第25-29页 |
| ·实验菌株 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25-26页 |
| ·实验主要仪器 | 第26-27页 |
| ·主要试剂的配置 | 第27-29页 |
| ·LB 培养基的配置 | 第27页 |
| ·磷酸盐缓冲液（PBS）的配置 | 第27页 |
| ·抗生素溶液的配置 | 第27页 |
| ·核酸和蛋白电泳所需溶液及胶的配置 | 第27-29页 |
| ·Western blot 所需溶液的配制 | 第29页 |
| ·NTA-Ni2+亲和柱纯化所需溶液的配制 | 第29页 |
| ·试验方法 | 第29-47页 |
| ·pET3C/HexD 重组质粒的构建 | 第29-35页 |
| ·重组蛋白 HexD 的表达、纯化及活性检测 | 第35-37页 |
| ·重组蛋白 HexD 的诱导表达 | 第35页 |
| ·NTA-Ni2+树脂纯化重组蛋白 HexD | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE 蛋白胶的配制及样品的制备 | 第36-37页 |
| ·酶的活性检测 | 第37页 |
| ·HexD 酶学特性的研究 | 第37-38页 |
| ·HexD 最适 pH 及 pH 稳定性 | 第37页 |
| ·HexD 热稳定性及最适反应温度 | 第37-38页 |
| ·不同金属离子对 HexD 酶活的影响 | 第38页 |
| ·生物底物的探索 | 第38-43页 |
| ·对荧光外源性底物的水解 | 第38-41页 |
| ·对糖肽的水解 | 第41-42页 |
| ·对糖脂的水解 | 第42-43页 |
| ·HexD 抗体的制备及检测 | 第43-44页 |
| ·HexD 基因的点突变 | 第44-47页 |
| ·突变引物的设计 | 第44-45页 |
| ·突变 PCR 体系及循环条件 | 第45-46页 |
| ·核酸电泳检测 | 第46页 |
| ·PCR 产物消化 | 第46页 |
| ·转化 | 第46页 |
| ·测序验证 | 第46页 |
| ·克隆表达 | 第46-47页 |
| 3. 结果与分析 | 第47-61页 |
| ·HexD 的表达和理化性质的分析 | 第47-48页 |
| ·pET3C/HexD 重组质粒酶切验证 | 第47页 |
| ·HexD 的诱导表达和纯化 | 第47-48页 |
| ·HexD 酶学特性的研究 | 第48-50页 |
| ·HexD 的最适 pH 值 | 第48-49页 |
| ·HexD 的热稳定性和最适反应温度 | 第49-50页 |
| ·不同金属离子对 HexD 酶活的影响 | 第50页 |
| ·生物底物的探索 | 第50-58页 |
| ·对荧光外源性底物的水解 | 第50-54页 |
| ·对糖肽的水解 | 第54-57页 |
| ·对糖脂的水解 | 第57-58页 |
| ·HexD 抗体的制备及检测 | 第58-59页 |
| ·HexD 催化机制的初探 | 第59-61页 |
| ·生物信息分析保守催化氨基酸 | 第59页 |
| ·HexD 基因的定点突变 | 第59-60页 |
| ·HexD 酶突变体酶活测试 | 第60-61页 |
| 4. 讨论 | 第61-64页 |
| ·HexD 的表达和理化性质的分析 | 第61-62页 |
| ·HexD 酶学特性的分析 | 第62页 |
| ·HexD 生物底物的探索 | 第62页 |
| ·HexD 抗体的制备及检测 | 第62页 |
| ·HexD 催化机制的初探 | 第62-64页 |
| 5. 结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
