| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 第1章 前言 | 第10-20页 |
| 1 胰岛素及其类似物 | 第10页 |
| 2 速效胰岛素 | 第10-11页 |
| 3 胰岛素的结构与功能 | 第11-15页 |
| ·胰岛素B22-23转角在胰岛素结构与功能中的作用 | 第12-13页 |
| ·胰岛素B链末端在胰岛素结构与功能中的作用 | 第13-15页 |
| 4 重组胰岛素的蛋白质表达系统 | 第15-16页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第15页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第15-16页 |
| 5 糖尿病防治的新方向 | 第16-17页 |
| ·转基因技术 | 第16页 |
| ·中药提取技术 | 第16-17页 |
| ·干细胞技术 | 第17页 |
| ·MicroRNAs与糖尿病 | 第17页 |
| 6 本论文的特点及创新性 | 第17-18页 |
| ·运用IMPACT-TWIN系统表达B22D特点与创新性 | 第17页 |
| ·毕赤酵母表达B27K的特点与创新性 | 第17-18页 |
| 7 实验设计 | 第18-20页 |
| ·内含肽介导的人胰岛素B22D表达流程如下图所示 | 第18-19页 |
| ·人胰岛素B22D的生物制备的设计流程 | 第19页 |
| ·人胰岛素B27K的生物制备实验的设计流程 | 第19-20页 |
| 第2章 胰岛素类似物B22D的生物制备 | 第20-39页 |
| 1 材料和仪器 | 第20-21页 |
| ·菌株和质粒 | 第20页 |
| ·主要生化试剂 | 第20页 |
| ·仪器 | 第20-21页 |
| 2 方法 | 第21-27页 |
| ·感受态制备及质粒转化 | 第21页 |
| ·质粒构建 | 第21-24页 |
| ·诱导表达 | 第24页 |
| ·破菌 | 第24-25页 |
| ·亲和纯化 | 第25-26页 |
| ·胰蛋白酶酶切实验 | 第26页 |
| ·HPLC鉴定与纯化 | 第26-27页 |
| 3. 结果 | 第27-37页 |
| ·质粒pTWINI-B22D的克隆、鉴定 | 第27-28页 |
| ·人胰岛素B22D前体融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第28-30页 |
| ·破菌及变复性方法一与方法二的比较 | 第30页 |
| ·剪切条件的优化 | 第30-33页 |
| ·人胰岛素B22D胰蛋白酶酶切 | 第33-35页 |
| ·HPLC-MS鉴定 | 第35-36页 |
| ·B22D产率计算 | 第36-37页 |
| 4. 结论与讨论 | 第37-39页 |
| ·讨论 | 第37页 |
| ·结论 | 第37-39页 |
| 第3章 人胰岛素B27K前体的生物制备 | 第39-55页 |
| 1 材料和仪器 | 第39-40页 |
| ·菌株 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·仪器 | 第39页 |
| ·其它材料 | 第39-40页 |
| 2 方法 | 第40-45页 |
| ·质粒DNA大量提取 | 第40页 |
| ·pPIC9K-B27K转化酵母细胞GS115 | 第40-41页 |
| ·基因拷贝数筛选 | 第41页 |
| ·重组质粒pPIC9K-B27K的小量表达 | 第41页 |
| ·重组质粒pPIC9K-B27K的5L发酵 | 第41-42页 |
| ·生长曲线及蛋白浓度测定 | 第42页 |
| ·人胰岛素B27K的纯化 | 第42-43页 |
| ·非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第43-44页 |
| ·HPLC鉴定与纯化 | 第44-45页 |
| 3. 结果 | 第45-54页 |
| ·高拷贝菌株的筛选 | 第45-47页 |
| ·发酵工艺的优化 | 第47-50页 |
| ·人胰岛素B27K前体的制备 | 第50-52页 |
| ·人胰岛素B27K前体的产率计算 | 第52页 |
| ·C8柱HPLC分离纯化 | 第52-53页 |
| ·SRT SEC-150柱HPLC分离纯化 | 第53-54页 |
| 4 结论与讨论 | 第54-55页 |
| ·讨论 | 第54页 |
| ·结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 已发表或已录用的主要学术论文 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62页 |