| 中文摘要 | 第1-25页 |
| Abstract | 第25-32页 |
| 符号说明 | 第32-33页 |
| 前言 | 第33-37页 |
| 第一章 人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞自噬的影响 | 第37-55页 |
| 第一节 人BNIP3的真核表达载体的构建及验证 | 第37-45页 |
| 材料与方法 | 第37-44页 |
| 1 材料 | 第37-40页 |
| ·质粒与菌株 | 第37-38页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第38页 |
| ·生化试剂 | 第38-39页 |
| ·一般试剂 | 第39-40页 |
| ·主要实验仪器 | 第40页 |
| 2 方法 | 第40-44页 |
| ·BNIP3编码区基因片段的PCR扩增、回收和纯化 | 第40-42页 |
| ·PCR扩增BNIP3编码区基因片段 | 第40-41页 |
| ·BNIP3编码区基因片段的大量扩增、回收和纯化 | 第41-42页 |
| ·目的基因与载体的连接和重组子的转化 | 第42页 |
| ·目的基因与载体的酶切、回收和纯化 | 第42页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第42页 |
| ·重组质粒的转化 | 第42页 |
| ·阳性重组子的筛选与鉴定 | 第42-43页 |
| ·阳性重组子的筛选与纯化 | 第42-43页 |
| ·酶切筛选阳性重组子 | 第43页 |
| ·DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 | 第43页 |
| ·RT-PCR和Western blot验证pcDNA3.1-BNIP3重组子 | 第43-44页 |
| 结果 | 第44-45页 |
| 1 pcDNA3.1 -BNIP3阳性克隆的筛选 | 第44页 |
| ·酶切筛选阳性重组子 | 第44页 |
| ·DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 | 第44页 |
| 2 pcDAN3.1 -BNIP3重组子的鉴定 | 第44-45页 |
| ·RT-PCR检测转染pcDNA3.1-BNIP3重组子的肝癌细胞中mRNA的表达 | 第44-45页 |
| ·Western blot检测转染pcDNA3.1-BNIP3重组子的肝癌细胞中BNIP3蛋白表达 | 第45页 |
| 小结 | 第45页 |
| 第二节 人BNIP3的shRNA表达载体构建及验证 | 第45-50页 |
| 材料与方法 | 第45-49页 |
| 1 材料 | 第45-47页 |
| ·质粒与菌株 | 第45页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第45-46页 |
| ·PCR引物设计 | 第46页 |
| ·生化试剂 | 第46-47页 |
| ·一般试剂 | 第47页 |
| ·主要实验仪器 | 第47页 |
| 2 方法 | 第47-49页 |
| ·BNIP3的shRNA表达载体的构建 | 第47-48页 |
| ·siRNA基因片段的退火形成互补链 | 第47页 |
| ·pSilencer3.1-H1 neo载体的酶切、回收和纯化 | 第47页 |
| ·siRNA片段与双酶切pSilencer3.1-H1 neo回收、纯化的线性载体的连接 | 第47-48页 |
| ·重组质粒的转化 | 第48页 |
| ·DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 | 第48页 |
| ·Real Time-PCR和Western blot验证pSilencer-BNIP3重组子 | 第48-49页 |
| ·脂质体介导的重组子转染 | 第48页 |
| ·Real Time-PCR检测转染pSilencer-BNIP3重组子的肝癌细胞中mRNA的表达 | 第48页 |
| ·Western blot检测转染pSilencer-BNIP3重组子的肝癌细胞中BNIP3蛋白表达 | 第48-49页 |
| 结果 | 第49页 |
| 1 DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 | 第49页 |
| 2 pSilencer-BNIP3重组子的鉴定 | 第49页 |
| ·Real Time-PCR检测转染pSilencer-BNIP3重组子的肝癌细胞中mRNA的表达 | 第49页 |
| ·Western blot检测转染pSilencer-BNIP3重组子的肝癌细胞中BNIP3蛋白表达 | 第49页 |
| 小结 | 第49-50页 |
| 第三节 pcDNA3.1-BNIP3和pSilencer-BNIP3对肝癌细胞自噬的影响 | 第50-51页 |
| 材料与方法 | 第50-51页 |
| 1 材料 | 第50页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第50页 |
| ·生化试剂 | 第50页 |
| ·一般试剂 | 第50页 |
| ·主要实验仪器 | 第50页 |
| 2 方法 | 第50-51页 |
| ·脂质体介导的重组子转染 | 第50页 |
| ·Western blot检测转染pcDNA3.1-BNIP3重组子的肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3B | 第50-51页 |
| ·Western blot检测转染pSilencer-BNIP3重组子的肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3B | 第51页 |
| 结果 | 第51页 |
| 1 pcDNA3.1 -BNIP3重组子对肝癌细胞自噬的影响 | 第51页 |
| 2 pSilencer-BNIP3重组子对肝癌细胞自噬的影响 | 第51页 |
| 小结 | 第51页 |
| 第一章 讨论 | 第51-53页 |
| 第一章 附图 | 第53-55页 |
| 第二章 肝癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制 | 第55-79页 |
| 第一节 动态模拟体内肝癌细胞的转移过程 | 第55-57页 |
| 材料与方法 | 第55-56页 |
| 1 材料 | 第55页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第55页 |
| ·生化试剂 | 第55页 |
| ·主要实验仪器 | 第55页 |
| 2 方法 | 第55-56页 |
| ·poly HEMA水凝胶细胞培养板(poly HEMA板)的制备 | 第55-56页 |
| ·肝癌转移的细胞模型的建立 | 第56页 |
| ·动态模拟肝癌细胞体内转移的过程 | 第56页 |
| 结果 | 第56-57页 |
| 1 肝癌细胞模型的建立 | 第56页 |
| 2 动态模拟肝癌细胞体内转移的过程 | 第56-57页 |
| 小结 | 第57页 |
| 第二节 抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3表达的分子调控机制研究 | 第57-62页 |
| 材料与方法 | 第57-61页 |
| 1 材料 | 第57-59页 |
| ·PCR引物 | 第57页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第57页 |
| ·生化试剂 | 第57-58页 |
| ·般试剂 | 第58-59页 |
| ·主要实验仪器 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-61页 |
| ·RT-PCR检测BNIP3和HIF-1α在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的表达情况 | 第59-60页 |
| ·Western blot检测BNIP3、HIF-1α和p-ERK1/2在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的表达情况 | 第60页 |
| ·Western blot检测抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3表达的时间依赖性 | 第60页 |
| ·ERK通路抑制剂对抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的调控机制研究 | 第60-61页 |
| 结果 | 第61页 |
| 1 BNIP3和HIF-1α在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中mRNA表达水平上调 | 第61页 |
| 2 BNIP3、HIF-1α和p-ERK1/2在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中蛋白表达水平上调 | 第61页 |
| 3 BNIP3在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的表达上调具有时间依赖性 | 第61页 |
| 4 ERK/HIF-1α通路调控抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的表达 | 第61页 |
| 小结 | 第61-62页 |
| 第三节 自噬在抵抗失巢凋亡肝癌细胞中的效应及分子调控机制的研究 | 第62-66页 |
| 材料与方法 | 第62-65页 |
| 1 材料 | 第62-63页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第62页 |
| ·生化试剂 | 第62页 |
| ·一般试剂 | 第62页 |
| ·主要实验仪器 | 第62-63页 |
| 2 方法 | 第63-65页 |
| ·Western blot检测抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的自噬 | 第63页 |
| ·Western blot检测在不同时间点的抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的自噬 | 第63页 |
| ·验证3-MA对抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的自噬的封闭效果 | 第63-64页 |
| ·3-MA对抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的效应研究 | 第64页 |
| ·Western blot检测mTOR通路上下游信号分子p-mTOR、p-S6K1、p-S6和p-4EBP1在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的表达情况 | 第64-65页 |
| ·Western blot检测mTOR通路上下游关键信号分子p-mTOR、p-S6K1和p-S6在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中不同时间点的表达情况 | 第65页 |
| ·Western blot检测mTOR通路激活剂胰岛素和抑制剂雷帕霉素对抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中mTOR关键信号转导分子mTOR和S6K1磷酸化水平及自噬的影响 | 第65页 |
| 结果 | 第65-66页 |
| 1 抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的自噬增加 | 第65页 |
| 2 抵抗失巢凋亡的肝癌细胞通过自噬维持存活 | 第65页 |
| 3 抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的自噬受mTOR通路的抑制调节 | 第65-66页 |
| 小结 | 第66页 |
| 第四节 BNIP3在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中的分子机制研究 | 第66-69页 |
| 材料与方法 | 第66-68页 |
| 1 材料 | 第66-67页 |
| ·质粒 | 第66页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第66页 |
| ·生化试剂 | 第66-67页 |
| ·一般试剂 | 第67页 |
| ·主要实验仪器 | 第67页 |
| 2 方法 | 第67-68页 |
| ·BNIP3小干扰RNA si-BNIP3的封闭效果验证 | 第67页 |
| ·si-BNIP3对抵抗失巢凋亡的肝癌细胞自噬的效应研究 | 第67页 |
| ·检测si-BNIP3对抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的细胞活力的效应 | 第67-68页 |
| ·检测转染si-BNIP3的抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中caspase3的活性 | 第68页 |
| ·Western blot检测转染si-BNIP3的抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的caspase3及其活性剪切体的表达 | 第68页 |
| 结果 | 第68-69页 |
| 1 si-BNIP3封闭肝癌细胞中BNIP3的表达 | 第68页 |
| 2 si-BNIP3抑制抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的中自噬 | 第68页 |
| 3 si-BNIP3能够有效逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗 | 第68-69页 |
| 小结 | 第69页 |
| 第二章 讨论 | 第69-73页 |
| 第二章 附图 | 第73-79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第82-83页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第83页 |
