| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-19页 |
| 前言 | 第19-23页 |
| 第一章 猪肠道碱性氨基酸转运载体RBAT、4F2HC 的电子克隆及序列验证 | 第23-46页 |
| 1 试验材料 | 第24-26页 |
| ·菌种和质粒 | 第24页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24-25页 |
| ·试剂配制 | 第25-26页 |
| ·PBS 缓冲液 | 第25页 |
| ·LB 培养基 | 第25页 |
| ·TE 缓冲液 | 第25-26页 |
| ·50 X TAE 电泳缓冲液pH8.0 (1L) | 第26页 |
| ·其它试剂 | 第26页 |
| ·试验动物 | 第26页 |
| 2 试验方法 | 第26-34页 |
| ·猪rBAT、4F2hc 基因EST 序列检索 | 第26-27页 |
| ·猪rBAT、4F2hc 基因EST 序列与人的比对分析、电子克隆 | 第27页 |
| ·猪rBAT、4F2hc 基因的RT-PCR 克隆验证 | 第27-34页 |
| ·组织样品采集 | 第27页 |
| ·总RNA 的提取及纯化 | 第27-30页 |
| ·总RNA 的提取 | 第28页 |
| ·总RNA 的普通琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| ·总RNA 的消化 | 第29页 |
| ·1%琼脂糖凝胶电泳 | 第29-30页 |
| ·猪肠道组织cDNA 合成 | 第30页 |
| ·PCR 扩增rBAT、4F2hc 基因cDNA 部分序列 | 第30-32页 |
| ·1%琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| ·PCR 产物回收 | 第32页 |
| ·目的基因片段的T/A 克隆 | 第32-34页 |
| ·目的基因与T 载体的连接 | 第32-33页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·重组质粒的转化 | 第33-34页 |
| ·克隆转化子的扩大培养 | 第34页 |
| ·重组质粒的PCR 鉴定 | 第34页 |
| ·序列测定 | 第34页 |
| ·序列比对分析 | 第34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-44页 |
| ·猪EST 序列的检索 | 第34-35页 |
| ·猪rBAT、4F2hc 基因cDNA 序列的电子克隆 | 第35-40页 |
| ·猪rBAT、4F2hc 基因cDNA 序列的试验验证 | 第40-44页 |
| ·猪肠道总RNA 制备 | 第40页 |
| ·RT-PCR 结果 | 第40-41页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第41-42页 |
| ·克隆片段的核苷酸序列和同源性比较 | 第42-44页 |
| 4 讨论 | 第44页 |
| 5 小结 | 第44-46页 |
| 第二章 猪肠道碱性氨基酸转运载体B~(0,+)AT、Y~+LAT1 的分子克隆 | 第46-72页 |
| 1 试验材料 | 第46-47页 |
| ·菌种和质粒 | 第46页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第46-47页 |
| ·主要仪器设备 | 第47页 |
| ·试剂配制 | 第47页 |
| ·试验动物 | 第47页 |
| 2 试验方法 | 第47-57页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 cDNA 部分序列的获取 | 第47-48页 |
| ·b~(0,+)AT 部分序列和y~+LAT1 的EST 序列检索及引物设计 | 第47-48页 |
| ·组织样品采集 | 第48页 |
| ·猪肠道总RNA 的提取 | 第48页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 已知片段至Poly A 尾端克隆(3'RACE) | 第48-51页 |
| ·SMART 3' cDNA 快速扩增(3'RACE)原理 | 第48页 |
| ·引物设计 | 第48页 |
| ·cDNA 第一链合成 | 第48-50页 |
| ·用GSP2 和UPM 进行第一轮PCR 扩增 | 第50页 |
| ·用NGSP2 和NUP 进行第二轮（nest）PCR 扩增 | 第50页 |
| ·PCR 产物回收 | 第50-51页 |
| ·3'RACE 产物的T/A 克隆 | 第51页 |
| ·序列测定 | 第51页 |
| ·序列比对分析 | 第51页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 已知片段至5'UTR 的克隆(5'RACE) | 第51-55页 |
| ·SMART 5' cDNA 末端快速扩增(5'RACE)原理 | 第51-52页 |
| ·引物设计 | 第52页 |
| ·cDNA 第一链合成 | 第52-53页 |
| ·用GSP1 和UPM 进行第一轮PCR 扩增 | 第53-54页 |
| ·用NGSP1 和NUP 进行第二轮（nest）PCR 扩增 | 第54-55页 |
| ·PCR 产物回收 | 第55页 |
| ·5'RACE 产物的T/A 克隆 | 第55页 |
| ·序列测定 | 第55页 |
| ·序列比对分析 | 第55页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 全基因序列ORF 的克隆 | 第55-56页 |
| ·引物设计 | 第55-56页 |
| ·PCR 扩增 | 第56页 |
| ·重组质粒的构建及克隆(T/A 克隆) 及测序 | 第56页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 的序列分析 | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-70页 |
| ·猪肠道总RNA 提取 | 第57页 |
| ·3'RACE 结果 | 第57-59页 |
| ·5'RACE 结果 | 第59-61页 |
| ·序列拼接 | 第61页 |
| ·ORF 的克隆 | 第61页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 的序列分析 | 第61-70页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 的核酸序列分析 | 第61-65页 |
| ·b~(0,+)AT、y~+LAT1 的蛋白序列分析 | 第65-70页 |
| ·理化性质分析 | 第65页 |
| ·跨膜区分析 | 第65-67页 |
| ·蛋白质序列比对及功能预测 | 第67-70页 |
| 4 讨论 | 第70-71页 |
| 5 小结 | 第71-72页 |
| 第三章 猪肠道碱性氨基酸转运载体RBAT、4F2HC 的 MRNA 表达发育性变化 | 第72-92页 |
| 1 试验材料 | 第72-75页 |
| ·菌种和质粒 | 第72页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第72页 |
| ·主要仪器设备 | 第72-73页 |
| ·试剂配制 | 第73页 |
| ·试验动物与饲养 | 第73-75页 |
| ·日粮组成及营养水平 | 第73-75页 |
| ·饲养管理 | 第75页 |
| 2 试验方法 | 第75-80页 |
| ·组织采样 | 第75-80页 |
| ·总RNA 的提取及纯化 | 第76页 |
| ·猪肠道组织cDNA 的合成 | 第76页 |
| ·引物的设计 | 第76页 |
| ·PCR 扩增rBAT、4F2hc 基因cDNA 部分序列 | 第76-77页 |
| ·PCR 产物回收 | 第77页 |
| ·目的基因片段的T/A 克隆 | 第77页 |
| ·重组质粒的提取 | 第77-78页 |
| ·序列测定 | 第78页 |
| ·序列比对分析 | 第78页 |
| ·荧光定量PCR | 第78页 |
| ·通过标准曲线筛选引物和模板的浓度 | 第78页 |
| ·实时荧光定量PCR 反应体系 | 第78-80页 |
| ·数据分析 | 第80页 |
| 3 结果与分析 | 第80-86页 |
| ·总RNA 的提取 | 第80页 |
| ·各目的基因RT-PCR 产物测序结果 | 第80页 |
| ·RFQ-PCR 标准曲线的建立 | 第80-81页 |
| ·猪肠道组织cDNA 的荧光定量结果 | 第81-86页 |
| ·长白和蓝塘猪十二指肠rBAT、4F2hc m RNA 表达的发育性变化 | 第81-83页 |
| ·十二指肠rBAT mRNA 表达的发育性变化 | 第81-82页 |
| ·十二指肠4F2hc mRNA 表达的发育性变化 | 第82-83页 |
| ·长白和蓝塘猪空肠rBAT、4F2hc m RNA 表达的发育性变化 | 第83-85页 |
| ·空肠rBAT mRNA 表达的发育性变化 | 第83-84页 |
| ·空肠4F2hc mRNA 表达的发育性变化 | 第84-85页 |
| ·长白和蓝塘猪回肠rBAT、4F2hc m RNA 表达的发育性变化 | 第85-86页 |
| ·回肠rBAT mRNA 表达的发育性变化 | 第85页 |
| ·回肠4F2hc mRNA 表达的发育性变化 | 第85-86页 |
| 4 讨论 | 第86-91页 |
| ·荧光定量的试验方法及数据统计 | 第86-89页 |
| ·rBAT 和4F2hc m RNA 在猪肠道中的发育性表达谱 | 第89-91页 |
| 5 小结 | 第91-92页 |
| 第四章 猪肠道碱性氨基酸转运载体MRNA 表达的组织特异性 | 第92-100页 |
| 1 试验材料 | 第92-93页 |
| ·菌种和质粒 | 第92页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第92页 |
| ·主要仪器设备 | 第92页 |
| ·试剂配制 | 第92-93页 |
| ·试验动物 | 第93页 |
| 2 试验方法 | 第93-95页 |
| ·组织采样 | 第93页 |
| ·总RNA 的提取及纯化 | 第93页 |
| ·猪各个组织cDNA 的合成 | 第93页 |
| ·引物的设计 | 第93-94页 |
| ·PCR 扩增rBAT、4F2hc 基因cDNA 部分序列 | 第94页 |
| ·PCR 产物回收 | 第94页 |
| ·目的基因片段的T/A 克隆 | 第94页 |
| ·重组质粒的提取 | 第94页 |
| ·序列测定 | 第94-95页 |
| ·序列比对分析 | 第95页 |
| ·荧光定量PCR | 第95页 |
| ·数据分析 | 第95页 |
| 3 结果与分析 | 第95-98页 |
| ·总RNA 的提取 | 第95页 |
| ·猪4F2hc mRNA 表达的组织特异性 | 第95-96页 |
| ·猪rBAT mRNA 表达的组织特异性 | 第96-97页 |
| ·猪b~(0,+)AT mRNA 表达的组织特异性 | 第97页 |
| ·猪y~+LAT1 mRNA 表达的组织特异性 | 第97-98页 |
| 4 讨论 | 第98-99页 |
| 5 小结 | 第99-100页 |
| 第五章 不同赖氨酸对体外培养的IEC 碱性氨基酸转运载体MRNA 表达的调控 | 第100-116页 |
| 1 试验材料 | 第101-102页 |
| ·试验动物 | 第101页 |
| ·主要仪器设备 | 第101页 |
| ·主要试剂及配制方法 | 第101-102页 |
| ·DMEM/F12 基础培养基的配制 | 第102页 |
| ·DMEM/F12 完全培养基（含双抗）的配制 | 第102页 |
| ·1%胶原酶Ⅱ型（10×母液）的配制 | 第102页 |
| ·PBS 缓冲液(pH=7.2) 的配制 | 第102页 |
| ·赖氨酸溶液(Sigma)(100mM) 的配制 | 第102页 |
| 2 试验方法 | 第102-105页 |
| ·猪小肠黏膜上皮细胞的分离培养 | 第102-103页 |
| ·传代培养 | 第103页 |
| ·赖氨酸对IEC 增殖的影响 | 第103-104页 |
| ·猪IEC 的鉴定 | 第104-105页 |
| ·碱性磷酸酶的鉴定 | 第104页 |
| ·免疫学方法鉴定 | 第104-105页 |
| ·不同赖氨酸浓度处理猪IEC 细胞 | 第105页 |
| ·总RNA 的提取和纯化 | 第105页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第105页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第105页 |
| 3 结果与分析 | 第105-112页 |
| ·猪IEC 的分离培养 | 第105-106页 |
| ·猪IEC 的鉴定 | 第106-107页 |
| ·碱性磷酸酶的鉴定 | 第106-107页 |
| ·免疫学方法鉴定 | 第107页 |
| ·赖氨酸对IEC 增殖的影响 | 第107-108页 |
| ·总RNA 的提取 | 第108-109页 |
| ·赖氨酸对猪碱性氨基酸转运载体mRNA 表达的影响 | 第109-112页 |
| ·赖氨酸对CAT-1 mRNA 表达的影响 | 第109页 |
| ·赖氨酸对CAT-2 mRNA 表达的影响 | 第109-110页 |
| ·赖氨酸对y~+LAT1 mRNA 表达的影响 | 第110-111页 |
| ·赖氨酸对4F2hc mRNA 表达的影响 | 第111页 |
| ·赖氨酸对b~(0,+)AT、rBAT mRNA 表达的影响 | 第111-112页 |
| 4 讨论 | 第112-114页 |
| ·猪IEC 的原代培养 | 第112-113页 |
| ·猪IEC 转运载体mRNA 的表达调控 | 第113-114页 |
| 5 小结 | 第114-116页 |
| 结论 | 第116-117页 |
| 创新点 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-131页 |
| 附录A 文献综述动物碱性氨基酸转运载体研究进展 | 第131-144页 |
| 附录B 技术路线 | 第144-145页 |
| 附录C：部分测序图谱（以ORF 测序为代表） | 第145-151页 |
| 附录D：荧光定量曲线 | 第151-153页 |
| 附录E：在学期间参加的科研课题、学术活动及发表的论文 | 第153-155页 |
