| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-15页 |
| ·不依赖于辅酶 B_(12)的甘油脱水酶 | 第10-11页 |
| ·丙酮酸甲酸裂解酶 | 第11-12页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶研究的意义 | 第12-15页 |
| 第二章 材料与方法 | 第15-27页 |
| ·实验材料 | 第15-16页 |
| ·菌株与质粒 | 第15页 |
| ·酶与试剂 | 第15页 |
| ·主要仪器设备 | 第15-16页 |
| ·方法与步骤 | 第16-27页 |
| ·深红螺菌的培养 | 第16页 |
| ·原始菌的发酵 | 第16页 |
| ·发酵产物的检测 | 第16页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶基因的克隆 | 第16-18页 |
| ·深红螺菌基因组 DNA的制备 | 第16-17页 |
| ·深红螺菌丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)及相关因子(pflA)扩增 | 第17-18页 |
| ·重组质粒的构建 | 第18-21页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第18-19页 |
| ·质粒 DNA的大量制备 | 第19页 |
| ·质粒 DNA的小量制备 | 第19-20页 |
| ·质粒载体与目的基因的连接 | 第20页 |
| ·连接产物化学法转化大肠杆菌感受态细胞 | 第20页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第20页 |
| ·重组子质粒的 PCR验证及测序分析 | 第20-21页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第21-22页 |
| ·含有重组质粒的工程菌的诱导表达 | 第21页 |
| ·表达产物的 SDS-PAGE检测 | 第21-22页 |
| ·重组酶的酶学性质研究 | 第22-24页 |
| ·工程菌粗酶液的制备 | 第22页 |
| ·丙酮酸甲酸裂解酶酶活的测定 | 第22页 |
| ·不依赖于辅酶 B_(12)的甘油脱水酶酶活的测定 | 第22-23页 |
| ·MBTH法测定甘油脱水酶 | 第22-23页 |
| ·原位法(In-situ)测定 | 第23页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第23-24页 |
| ·酶动力学参数的测定 | 第24页 |
| ·丙酮酸甲酸裂解酶催化机理的初步鉴定 | 第24-26页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶催化机理的推断 | 第24页 |
| ·催化功能相关位点突变体的构建与验证 | 第24-25页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶催化机理的初步鉴定 | 第25-26页 |
| ·同源建模及结果分析 | 第26-27页 |
| 第三章 结果与分析 | 第27-40页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因的功能鉴定 | 第27-35页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶及其激活因子基因的克隆和序列分析 | 第27-29页 |
| ·重组表达质粒pET30a-pflB和pET30a-pflAB的构建 | 第29页 |
| ·重组表达质粒的诱导表达及 SDS-PAGE检测 | 第29-30页 |
| ·重组酶粗酶液的制备及酶学性质的研究 | 第30页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶催化机理的推断 | 第30-34页 |
| ·R.rub的 PFL的氨基酸序列比对、保守区域分析及功能推测 | 第32-34页 |
| ·突变体 G432A、C433A和 G432A/C433A的构建 | 第34页 |
| ·突变体酶的酶活测定及与野生型酶活的比较 | 第34-35页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶关于不依赖于辅酶 B_(12)的甘油脱水酶活性的研究 | 第35-40页 |
| ·深红螺菌原始菌发酵及发酵产物中1，3-丙二醇的检测 | 第35-38页 |
| ·深红螺菌裂解液的甘油脱水酶酶活测定 | 第38页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶基因克隆表达后粗酶液的甘油脱水酶酶活的测定 | 第38-40页 |
| 第四章 讨论 | 第40-45页 |
| ·深红螺菌中丙酮酸甲酸裂解酶催化机理 | 第40-41页 |
| ·丙酮酸甲酸裂解酶与不依赖于辅酶 B_(12)的甘油脱水酶的关系 | 第41-45页 |
| 第五章 结论与展望 | 第45-47页 |
| ·结论 | 第45页 |
| ·问题与展望 | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 附录 | 第50-55页 |
| 致谢 | 第55-56页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第56页 |
