| 原创性声明 | 第1页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩略语表 | 第8-10页 |
| 第一部 分文献综述 | 第10-46页 |
| 第一章 流行性乙型脑炎病毒的研究进展 | 第10-38页 |
| ·乙脑历史 | 第10页 |
| ·乙脑流行特征及危害 | 第10-12页 |
| ·乙脑的病原学特性 | 第12-13页 |
| ·分类及生物学特性 | 第12页 |
| ·血凝特性 | 第12页 |
| ·增殖特性 | 第12-13页 |
| ·致病机制 | 第13-14页 |
| ·乙脑病毒的分子生物学特性 | 第14-23页 |
| ·基因组结构与功能 | 第14-16页 |
| ·JEV蛋白的结构与功能 | 第16-23页 |
| ·结构蛋白 | 第16-20页 |
| ·C蛋白 | 第16页 |
| ·M蛋白 | 第16-17页 |
| ·E蛋白 | 第17-20页 |
| ·非结构蛋白 | 第20-23页 |
| ·NS1蛋白 | 第20-22页 |
| ·NS2蛋白 | 第22页 |
| ·NS3蛋白 | 第22-23页 |
| ·NS4蛋白 | 第23页 |
| ·NS5蛋白 | 第23页 |
| ·抗原性 | 第23-25页 |
| ·乙型脑炎病毒的变异和分型 | 第25-26页 |
| ·乙脑的诊断 | 第26-30页 |
| ·病原学检测 | 第26-28页 |
| ·血清学诊断 | 第28-30页 |
| ·乙脑的防治 | 第30-31页 |
| ·日本脑炎疫苗研究现状及展望 | 第31-38页 |
| ·传统疫苗 | 第31-32页 |
| ·灭活苗 | 第31-32页 |
| ·弱毒苗 | 第32页 |
| ·新型疫苗 | 第32-36页 |
| ·活载体疫苗 | 第32-34页 |
| ·亚单位疫苗 | 第34-35页 |
| ·DNA疫苗 | 第35-36页 |
| ·展望 | 第36-38页 |
| 第二章 抗体Fc片段融合蛋白与SPA协同凝集试验的研究进展 | 第38-46页 |
| 1 抗体Fc片段融合蛋白的研究进展 | 第38-40页 |
| 2 葡萄球菌蛋白A(SPA)及SPA协同凝集试验的研究进展 | 第40-46页 |
| 一、SPA的性质 | 第40-41页 |
| 二、SPA的应用 | 第41-46页 |
| 第二部分 研究内容 | 第46-92页 |
| 第三章 流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域与猪IgG_1-pFc片段在大肠杆菌中的融合表达 | 第46-69页 |
| 1 材料与方法 | 第47-58页 |
| ·质粒与菌株 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47页 |
| ·主要仪器 | 第47-48页 |
| ·引物设计 | 第48页 |
| ·猪IgG1-Fc片段基因的扩增 | 第48-49页 |
| ·猪外周血白细胞的分离及诱导培养 | 第48页 |
| ·猪全血淋巴细胞总RNA的提取 | 第48页 |
| ·cDNA第一条链的合成 | 第48-49页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第49页 |
| ·pFc 基因的克隆 | 第49-51页 |
| ·PCR产物的回收 | 第49页 |
| ·pFc基因与克隆载体pMD18-T的连接 | 第49-50页 |
| ·DHSα感受态细胞的制备 | 第50页 |
| ·连接产物转化DHSα感受态细胞 | 第50页 |
| ·重组克隆载体的酶切鉴定和pFc基因的序列测定及分析 | 第50-51页 |
| ·质粒的小量提取 | 第50-51页 |
| 1 .6.5.2 重组克隆载体pMD18-pFc的酶切鉴定 | 第51页 |
| ·序列测定与分析 | 第51页 |
| 1 .7重组表达载体pET-E-pFc的构建与鉴定 | 第51-53页 |
| ·pFc基因片段与重组表达载体pET-E片段的回收 | 第51页 |
| ·pFc基因片段与重组表达载体pET-E片段的连接 | 第51-52页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞 | 第52页 |
| ·转化BL21(DE3)感受态细胞 | 第52页 |
| ·重组表达载体pET-E-pFc的酶切鉴定及测序分析 | 第52-53页 |
| ·质粒的小量提取 | 第52-53页 |
| ·IPTG诱导表达 | 第53页 |
| ·菌体的超声波裂解 | 第53页 |
| ·表达产物的可溶性分析 | 第53页 |
| ·重组蛋白E-pFc和E的His·Bind螯合层析柱纯化 | 第53-54页 |
| ·His·BindHis·Bind螯合层析柱的预备 | 第53-54页 |
| ·柱层析 | 第54页 |
| ·重组蛋白E-pFc的SPA亲和层析柱纯化 | 第54页 |
| ·纯化重组蛋白E-pFc和E的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 分析 | 第54-56页 |
| ·样品的处理 | 第54页 |
| ·Tris-甘氨酸 SDS-PAGE凝胶的配方 | 第54-55页 |
| ·Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶的灌制与电泳 | 第55-56页 |
| ·纯化重组蛋白E-pFc和E的Western Blotting分析 | 第56-58页 |
| ·纯化重组蛋白E-pFc和E的定量 | 第58页 |
| ·纯化重组蛋白E-pFc和E的iELISA分析 | 第58页 |
| 2 结果 | 第58-60页 |
| ·猪IgG1-Fc片段基因的克隆 | 第58页 |
| ·pFc基因的序列测定及分析 | 第58-59页 |
| ·推导的pFc片段氨基酸序列分析 | 第59页 |
| ·重组表达载体pET-E-pFc与pET-E的酶切鉴定 | 第59页 |
| ·表达产物的可溶性分析 | 第59页 |
| ·重组蛋白纯化效果的SDS-PAGE分析 | 第59-60页 |
| ·纯化重组蛋白E-pFc和E的定量 | 第60页 |
| ·纯化重组蛋白E-pFc和E的Western Blotting和iELISA分析 | 第60页 |
| 3 讨论 | 第60-69页 |
| 第四章 检测猪流行性乙型脑炎病毒抗体的新型SPA协同凝集试验的建立 | 第69-84页 |
| 1 材料与方法 | 第70-76页 |
| ·菌株与血清 | 第70页 |
| ·主要试剂及器材 | 第70页 |
| ·SPA稳定液的制备 | 第70页 |
| ·致敏 | 第70-71页 |
| 1 .5 快速玻片SPA协同凝集试验操作方法及判断标准 | 第71页 |
| ·操作方法 | 第71页 |
| ·判断标准: | 第71页 |
| ·微量SPA协同凝集试验操作方法及判断标准 | 第71-72页 |
| ·操作方法 | 第71页 |
| ·判断标准: | 第71-72页 |
| ·血清的预处理 | 第72-74页 |
| · | 第72页 |
| ·兔抗葡萄球菌Cowan I株和大肠杆菌BL21(DE3)抗体的制备及其抗体检测的iELISA的建立 | 第72-73页 |
| ·葡萄球菌Cowan I株和大肠杆菌BL21(DE3)抗体与SPA协同凝集 试验中非特异性凝集的相关性分析 | 第73页 |
| ·血清中葡萄球菌抗体的吸附消除 | 第73-74页 |
| ·新型SPA协同凝集试验的建立 | 第74-75页 |
| ·致敏条件的优化 | 第74页 |
| ·致敏SPA菌悬液最适工作浓度的测定 | 第74-75页 |
| ·最适反应温度和反应时间的确立 | 第75页 |
| ·致敏SPA菌悬液质量检验 | 第75页 |
| ·自凝性检验 | 第75页 |
| ·特异性检验 | 第75页 |
| ·重复性试验和保存期试验 | 第75页 |
| ·纯化的重组融合蛋白与包涵体致敏葡萄球菌的比较 | 第75页 |
| ·与血凝抑制试验、乳胶凝集试验检测猪流行性乙型脑炎抗体的比较 | 第75页 |
| ·数据统计与分析 | 第75-76页 |
| 2 结果 | 第76-78页 |
| ·兔抗葡萄球菌Cowan I株和大肠杆菌BL21(DE3)抗体的制备及其抗体检测的iELISA的建立 | 第76页 |
| ·葡萄球菌Cowan I株和大肠杆菌BL21(DE3)抗体与SPA协同凝集试验中非特异性凝集的相关性分析 | 第76页 |
| ·Wood46株葡萄球菌吸附最佳用量和最佳吸附时间的确定 | 第76页 |
| ·吸附前后抗金黄色葡萄球菌抗体水平的变化 | 第76页 |
| ·致敏条件的优化的结果 | 第76-77页 |
| ·致敏SPA菌悬液最适工作浓度的测定 | 第77页 |
| ·微量SPA协同凝集试验的最适反应温度和反应时间的确立 | 第77页 |
| ·致敏SPA菌悬液质量检验结果 | 第77页 |
| ·自凝性检验和特异性检验结果 | 第77页 |
| ·重复性试验和保存期试验结果 | 第77页 |
| ·纯化的重组融合蛋白与包涵体致敏葡萄球菌的比较 | 第77-78页 |
| ·与血凝抑制试验检测猪流行性乙型脑炎抗体的比较 | 第78页 |
| 3 讨论 | 第78-84页 |
| 第五章 新型免疫复合物──融合蛋白E-pFc诱导BALB/c小鼠产生抗JEV特异性免疫效果的评价 | 第84-92页 |
| 1 材料与方法 | 第85-87页 |
| ·病毒、疫苗和实验动物 | 第85页 |
| ·主要试剂和材料 | 第85页 |
| ·动物的分组与免疫 | 第85页 |
| ·T淋巴细胞增殖情况的MTT法 | 第85-86页 |
| ·脾淋巴细胞的获取 | 第85-86页 |
| ·MTT分析 | 第86页 |
| ·乙脑病毒抗体和抗体亚型检测 | 第86页 |
| ·中和抗体测定 | 第86页 |
| ·血清中IL-4和IFN-γ的测定 | 第86页 |
| ·统计分析 | 第86-87页 |
| 2 结果 | 第87页 |
| ·MTT | 第87页 |
| ·乙脑病毒特异性抗体抗体亚型检测 | 第87页 |
| ·中和抗体检测 | 第87页 |
| ·细胞因子IL-4和IFN-γ的定量ELISA检测 | 第87页 |
| 3 讨论 | 第87-92页 |
| 参考文献 | 第92-102页 |
| 全文总结 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
