| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-36页 |
| 1． 表皮生长因子研究进展 | 第14-25页 |
| 1．1 EGF的组成及分子结构 | 第14-15页 |
| 1．2 EGF的合成与分布 | 第15-16页 |
| 1．3 EGF受体 | 第16-18页 |
| 1．3．1 EGFR的结构 | 第16-17页 |
| 1．3．2 EGFR的分布 | 第17页 |
| 1．3．3 EGFR活化与信号转导机制 | 第17-18页 |
| 1．4 EGF的生物学效应及临床应用 | 第18-22页 |
| 1．4．1 促上皮细胞生长的作用 | 第18-19页 |
| 1．4．2 抗细胞衰老的作用 | 第19页 |
| 1．4．3 促血管生成的作用 | 第19页 |
| 1．4．4 促肿瘤生长的作用 | 第19页 |
| 1．4．5 促肝损伤修复和再生的作用 | 第19页 |
| 1．4．6 保护呼吸系统的作用 | 第19-20页 |
| 1．4．7 刺激生殖系统的作用 | 第20页 |
| 1．4．8 促进角膜等眼组织生长的作用 | 第20-21页 |
| 1．4．9 在神经系统中的作用 | 第21页 |
| 1．4．10 对消化系统的作用及临床应用 | 第21-22页 |
| 1．5 EGF对皮肤的作用 | 第22-25页 |
| 1．5．1 对细胞周期的作用 | 第22-23页 |
| 1．5．2 维护皮肤细胞外基质的作用 | 第23页 |
| 1．5．3 促进皮肤毛细血管的生成 | 第23-24页 |
| 1．5．4 促进细胞存活 | 第24页 |
| 1．5．5 延缓皮肤衰老的作用 | 第24-25页 |
| 1．5．6 对皮肤癌的抑制作用 | 第25页 |
| 2． 转基因番茄研究进展 | 第25-34页 |
| 2．1 转基因延熟番茄的研究 | 第25-27页 |
| 2．1．1 抑制番茄细胞壁降解的研究 | 第25-26页 |
| 2．1．2 抑制番茄乙烯合成的研究 | 第26-27页 |
| 2．2 转基因抗病番茄的研究 | 第27-29页 |
| 2．2．1 番茄抗病毒病基因工程 | 第27-28页 |
| 2．2．2 番茄抗真菌及细菌病基因工程 | 第28-29页 |
| 2．3 番茄抗虫基因工程 | 第29-30页 |
| 2．4 番茄抗除草剂基因工程 | 第30页 |
| 2．5 番茄抗逆基因工程 | 第30-31页 |
| 2．6 番茄品质改良的研究 | 第31-33页 |
| 2．7 延缓番茄叶衰老的转基因研究 | 第33页 |
| 2．8 番茄雄性不育基因工程研究 | 第33页 |
| 2．9 利用番茄作为生物反应器 | 第33-34页 |
| 2．10 番茄基因工程展望 | 第34页 |
| 3． 开题设想 | 第34-36页 |
| 第二部分 人表皮生长因子转基因番茄 | 第36-76页 |
| Ⅰ 实验材料与方法 | 第36-45页 |
| 1 实验材料 | 第36-39页 |
| 1．1 番茄品系 | 第36页 |
| 1．2 动物品系 | 第36页 |
| 1．3 质粒与菌株 | 第36页 |
| 1．4 酶和试剂 | 第36页 |
| 1．5 主要仪器和设备 | 第36-37页 |
| 1．6 细菌培养基 | 第37页 |
| 1．7 植物组织培养培养基配制 | 第37-38页 |
| 1．8 主要溶液 | 第38-39页 |
| 2 实验方法 | 第39-45页 |
| 2．1 番茄偏爱型hEGF基因的设计及合成 | 第39页 |
| 2．2 植物表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 2．2．1 质粒小量提取 | 第39页 |
| 2．2．2 质粒 DNA的限制性酶切 | 第39页 |
| 2．2．3 重组质粒的连接 | 第39-40页 |
| 2．2．4 感受态细菌的制备 | 第40页 |
| 2．2．5 质粒的转化 | 第40页 |
| 2．2．6 重组质粒的筛选与鉴定 | 第40页 |
| 2．2．7 PCR克隆 | 第40页 |
| 2．3 番茄的转化及再生 | 第40-41页 |
| 2．3．1 番茄无菌苗的培养 | 第40页 |
| 2．3．2 外植体的获得及处理 | 第40页 |
| 2．3．3 工程菌的获得及活化 | 第40-41页 |
| 2．3．4 外植体的转化 | 第41页 |
| 2．3．5 筛选及分化培养 | 第41页 |
| 2．3．6 生根培养 | 第41页 |
| 2．3．7 温室移栽 | 第41页 |
| 2．3．8 再生植株的生长、开花和结果 | 第41页 |
| 2．4 再生植株的分子检测 | 第41-44页 |
| 2．4．1 植物基因组 DNA的小量快速提取 | 第41-42页 |
| 2．4．2 CTAB法大量提取植物基因组 DNA | 第42页 |
| 2．4．3 聚合酶链式反应(PCR)检测 | 第42-43页 |
| 2．4．4 PCR Southern blotting分析 | 第43-44页 |
| 2．5 番茄果实中目的蛋白表达量的测定 | 第44-45页 |
| 2．5．1 果实中蛋白质的提取 | 第44页 |
| 2．5．2 放射免疫法测定蛋白质的含量 | 第44-45页 |
| 2．5．3 不同条件下的稳定性实验 | 第45页 |
| 2．6 表达产物对实验动物急性胃溃疡的防治 | 第45页 |
| 2．6．1 hEGF对实验动物胃粘膜的保护作用 | 第45页 |
| 2．6．2 hEGF对胃溃疡模型动物的治疗作用 | 第45页 |
| Ⅱ 实验结果与分析 | 第45-71页 |
| 1． 番茄偏爱型hEGF基因的设计及合成 | 第45-47页 |
| 2． p2300-35S-hEGF表达载体的构建 | 第47-54页 |
| 2．1 含hEGF目的基因片段的获取 | 第48-49页 |
| 2．2 在目的基因的3’端添加 NOS终止子序列 | 第49-50页 |
| 2．3 在目的基因的5’端添加 CaMV35S启动子 | 第50-52页 |
| 2．4 hEGF基因表达盒与载体pCAMBIA2300的连接 | 第52-54页 |
| 3． p2300-2A11-hEGF表达载体的构建 | 第54-58页 |
| 3．1 2A11启动子的获得 | 第55-56页 |
| 3．2 2A11与pGEM-T Vector连接鉴定 | 第56-57页 |
| 3．3 2A11启动子更换p2300-35S-hEGF中的 CaMV35S启动子 | 第57-58页 |
| 4． 番茄的转化及植株再生 | 第58-59页 |
| 4．1 不同基因型材料对愈伤组织诱导的影响 | 第58页 |
| 4．2 激素对愈伤组织诱导的影响 | 第58页 |
| 4．3 不同工程菌对诱导愈伤的影响 | 第58-59页 |
| 4．4 转基因植株的获得 | 第59页 |
| 5． 再生植株的分子鉴定 | 第59-64页 |
| 5．1 再生当代植株的基因组 DNA提取 | 第60页 |
| 5．2 再生当代植株的 PCR分析 | 第60-61页 |
| 5．2．1 以 LBA4404为工程菌的转化情况 | 第60-61页 |
| 5．2．2 以 C58为工程菌的转化情况 | 第61页 |
| 5．3 再生当代植株的 PCR-Southern分析 | 第61-62页 |
| 5．4 再生当代植株的 PCR产物测序鉴定 | 第62页 |
| 5．5 T1代植株 PCR及 PCR-Southern检测 | 第62-63页 |
| 5．6 T2代植株 PCR检测 | 第63-64页 |
| 6． 番茄果实中目的蛋白表达量的测定 | 第64-66页 |
| 6．1 转 LBA4404/p2300-35S-hEGF番茄中hEGF的含量 | 第64页 |
| 6．2 转 LBA4404/p2300-2A11-hEGF番茄中hEGF的含量 | 第64-65页 |
| 6．3 转 C58/p2300-2A11-hEGF番茄中hEGF的含量 | 第65-66页 |
| 7． 表达产物稳定性分析 | 第66-67页 |
| 8． 对实验动物急性胃溃疡的防治 | 第67-71页 |
| 8．1 转p2300-35S-hEGF果实对实验动物的胃粘膜保护作用 | 第67-69页 |
| 8．2 转p2300-2A11-hEGF果实对实验动物胃粘膜的保护作用 | 第69-70页 |
| 8．3 转p2300-2A11-hEGF果实对实验动物胃溃疡的治疗作用 | 第70-71页 |
| Ⅲ 讨论与结论 | 第71-76页 |
| 1 讨论 | 第71-74页 |
| 1．1 番茄再生体系的建立 | 第71-72页 |
| 1．2 不同启动子在外源蛋白表达上的影响 | 第72页 |
| 1．3 PCR产物测序的应用 | 第72-73页 |
| 1．4 转基因当代外源蛋白的表达情况 | 第73页 |
| 1．5 转基因后代植株基因沉默的可能原因分析 | 第73-74页 |
| 1．6 转基因番茄抵抗酒精引起的胃溃疡的机制探讨 | 第74页 |
| 2 结论 | 第74-76页 |
| 第三部分 人 EGF融合蛋白的原核表达 | 第76-106页 |
| Ⅰ 实验背景及目的 | 第76页 |
| Ⅱ 材料与方法 | 第76-86页 |
| 1 实验材料 | 第76-79页 |
| 1．1 菌株和质粒 | 第76-77页 |
| 1．2 酶和试剂 | 第77页 |
| 1．3 实验细胞 | 第77页 |
| 1．4 动物品系 | 第77页 |
| 1．5 主要仪器设备 | 第77-78页 |
| 1．6 主要溶液与培养基 | 第78-79页 |
| 2 实验方法 | 第79-86页 |
| 2．1 pGEX-4T-1-hEGF表达载体的构建 | 第79页 |
| 2．2 重组表达载体pGEX-4T-1-hEGF的鉴定 | 第79-80页 |
| 2．2．1 PCR鉴定 | 第79页 |
| 2．2．2 酶切鉴定 | 第79-80页 |
| 2．3 重组 GST-hEGF基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第80页 |
| 2．4 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 | 第80页 |
| 2．5 表达产物的Western blotting实验 | 第80-81页 |
| 2．6 hEGF融合蛋白表达形式的确定 | 第81页 |
| 2．7 重组 GST-hEGF融合蛋白的纯化 | 第81-83页 |
| 2．8 pPTD-hEGF表达载体的构建 | 第83-84页 |
| 2．8．1 PCR引物的设计 | 第83页 |
| 2．8．2 目的基因的克隆 | 第83页 |
| 2．8．3 目的基因与pGEM一T载体的连接 | 第83页 |
| 2．8．4 pPTD-hEGF重组表达载体的构建 | 第83-84页 |
| 2．8．5 对重组表达载体鉴定 | 第84页 |
| 2．9 PTD-hEGF融合表达产物的 MALDI-TOF-MS分析 | 第84页 |
| 2．10 重组 PTD-hEGF融合蛋白的分离纯化 | 第84-85页 |
| 2．11 纯化液中hEGF融合蛋白含量的测定 | 第85页 |
| 2．12 细胞水平上测定融合蛋白的生物活性 | 第85-86页 |
| 2．12．1 细胞培养 | 第85-86页 |
| 2．12．2 MTS检测法 | 第86页 |
| 2．12．3 皮下注射融合蛋白对新生小鼠的作用 | 第86页 |
| 2．12．4 口服融合蛋白对新生小鼠的作用 | 第86页 |
| Ⅲ 实验结果与分析 | 第86-102页 |
| 1． 重组表达载体pGEX-4T-1-hEGF的构建 | 第86-89页 |
| 1．1 含hEGF目的基因片段的获得 | 第87页 |
| 1．2 目的载体片段的获得 | 第87-88页 |
| 1．3 重组质粒的鉴定 | 第88-89页 |
| 1．3．1 PCR鉴定 | 第88-89页 |
| 1．3．2 BamH I和 EcoR I双酶切鉴定 | 第89页 |
| 2． 重组工程菌的获得与鉴定 | 第89页 |
| 3． 工程菌的诱导表达 | 第89-90页 |
| 4． Western blotting检测表达蛋白 | 第90-91页 |
| 5． hEGF融合蛋白表达形式的确定 | 第91页 |
| 6． pPTD-hEGF表达载体的构建 | 第91-94页 |
| 6．1 目的基因的克隆 | 第91-92页 |
| 6．2 pGEM-hEGF中间表达载体的构建 | 第92-93页 |
| 6．2．1 质粒电泳鉴定 | 第92页 |
| 6．2．2 重组质粒的 PCR鉴定 | 第92-93页 |
| 6．3 含 Kpn I和 EcoR I hEGF基因片段的获得 | 第93页 |
| 6．4 目的载体片段的获得 | 第93-94页 |
| 6．5 重组表达载体pPTD-hEGF鉴定 | 第94页 |
| 7． PTD-hEGF融合蛋白的表达 | 第94-95页 |
| 8． 重组蛋白表达形式的分析 | 第95页 |
| 9． Western blotting分析 | 第95-96页 |
| 10． MALDI-TOF-MS分析 PTD-hEGF融合蛋白 | 第96-97页 |
| 11． 重组hEGF融合蛋白的亲合层析纯化 | 第97-98页 |
| 11．1 GST-hEGF亲和层析纯化 | 第97页 |
| 11．2 PTD-hEGF融合蛋白的纯化 | 第97-98页 |
| 12． 洗脱液中目的蛋白含量的测定 | 第98-99页 |
| 13． 重组 GST-hEGF融合蛋白的促细胞增殖活性 | 第99-100页 |
| 14． 重组 PTD-hEGF融合蛋白的促细胞增殖活性 | 第100-101页 |
| 15． 皮下注射hEGF融合蛋白对新生小鼠的影响 | 第101页 |
| 16． 口服hEGF融合蛋白对新生小鼠的影响 | 第101-102页 |
| Ⅳ 讨论与结论 | 第102-106页 |
| 1 讨论 | 第102-104页 |
| 1．1 GST-hEGF融合蛋白的表达及活性 | 第102-103页 |
| 1．2 PTD-hEGF融合蛋白的表达及活性 | 第103页 |
| 1．3 重组hEGF融合蛋白的生化药理性质 | 第103-104页 |
| 1．3．1 血清对细胞生长和rhEGF生物活性检测的影响 | 第103-104页 |
| 1．3．2 酶解程度对rhEGF生物活性检测的影响 | 第104页 |
| 1．3．3 细胞传代培养时间对rhEGF生物活性检测的影响 | 第104页 |
| 1．3．4 细胞浓度对检测的影响 | 第104页 |
| 2 结论 | 第104-106页 |
| 第四部分 论文总结 | 第106-108页 |
| 参考文献 | 第108-117页 |
| 在读期间发表论文及申请专利情况 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118页 |
